白花泡桐叶和茎的cDNa-SRAP差异表达分析

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泡桐作为一种快速增长的经济林树种,从属于玄参科(Scrophulariaceae),原产于我国。其物种资源丰富,分布广泛,在木材加工应用、生态观赏及医学应用研究方面有较高的经济价值和生态效益。叶作为泡桐的重要器官,通过光合作用和呼吸作用为植株提供生长发育所需要的能量,同时储存养分和有机物,对泡桐的生命活动起着重要的作用。研究叶在林木生长发育中基因表达的相关情况,为泡桐生长发育基因工程探索提供有效数据。cDNA-SRAP(cDNA-sequence-related amplified polymorphism)技术作为一种适用于差异表达分析的转录组分析技术,其操作简便、试验程序简单,重复性强、试验成本低,可以多个样本间进行比较分析,在没有己知序列的前提下,仍可进行差异比对分析,具有高频共显性标记。本试验采用cDNA-SRAP技术尝试对泡桐叶和茎进行差异分析,以期在基因表达层面上了解泡桐组织器官间差异及叶生长发育相关基因的表达情况,探索其可能在泡桐生长过程中的表达调控机制。具体研究结果如下:  1)通过cDNA-SRAP分子标记技术方法的研究,以提取的白花泡桐RNA,经过逆转录合成cDNA第一条链为反应模板,根据其技术原理,从64对设计的引物序列中筛选出25对扩增较好的适用于泡桐差异表达分析的引物组合。cDNA-SRAP反应体系总体积为25μL:10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,cDNA模板0.5μL,dNTP2.5mmol·L-11μL,Taq DNA polymerase5U·μL-10.2μL,正向反向引物各0.5μL,双蒸H2O19.8μL。PCR反应程序为:94℃预变性4min;94℃变性45s,36℃复性45s,72℃延伸1min,共进行35个循环;72℃修复延伸10min,4℃终止反应保存。  2)通过对白花泡桐叶和茎在筛选出的25对引物下进行重复二次SRAP反应体系扩增中的差异片段进行分析,最终从中筛选出23条有明显差异表达的条带,片段长度主要在400~1700bp之间,两次PCR扩增重复率为66.8%,其中6条在叶中单独表达,15条与茎相比高表达。将差异条带进行切胶回收、并进行克隆测序,在NCBl系统中进行BLASTX同源性比对分析,其中有近70%的差异片段测序结果与已知蛋白序列有较高的同源性,包含能量与代谢、蛋白质合成、细胞壁相关、信号传导与胁迫响应及复合影响等多个方面。  3)选取差异片断对其进行实时荧光定量PCR分析,验证cDNA-SRAP结果的准确性,运用相对定量分析方法及2-(ΔΔCt)计算方法,选取管家基因18S rRNA作为内参基因,分别对目的基因在两器官间的表达量进行比对,结果证明cDNA-SRAP扩增出的差异表达条带为阳性克隆条带,与实时荧光定量PCR表达结果相符合。
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