胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤,病死率逾90%,肿瘤无法切除患者的中位生存期仅6个月。全世界每年约有20万人死于此病,且发病率有逐年增高的趋势。外科手术是目前能够根治胰腺癌的唯一手段,但因早期症状不明显,多数患者在确诊时已至中晚期,可获根治性切除者仅10%～15%,术后5年生存率仅1%～3%,复发率近80%,肿瘤的局部复发是胰腺癌术后治疗失败的主要原因。因此,需要采取综合治疗手段包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、支持治疗等延长患者的生存时间,减轻临床症状,提高生活质量。尽管传统的化疗药物,提高了患者的生存时间,但是肿瘤细胞的耐药和各种急慢性毒副作用严重限制了其临床应用。分子靶向治疗是通过靶向肿瘤细胞表面特异性分子的配体与药物、放射性核素或生物毒素等偶联,靶向性杀伤肿瘤细胞。由于作用靶位明确,药物通常具有很高的选择性,可以有效的杀伤或抑制靶细胞,而对正常组织细胞不产生或仅产生较小的毒副作用。因此,分子靶向药物的研制已成为肿瘤临床研究的热点。人滋养层细胞表面抗原2(]human trophoblast cell surface antigen2, Trop-2)是一种细胞表面糖蛋白,属于TACSTD基因家族,它在正常组织低表达或不表达,而在多种上皮癌过表达,如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等。临床资料表明,Trop-2的表达水平和肿瘤的侵袭性和转移性呈正相关,而与病人的预后呈负相关。Trop-2不仅与细胞内钙离子浓度和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)以及磷酸激酶C的(PKC)调控有关,同时还可能激活ERK途径,从而调节肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。最新研究表明,Trop-2还具有肿瘤干细胞特性。因此,Trop-2可作为许多恶性肿瘤早期诊断及靶向治疗的候选分子。全分子抗体因分子量较大,其组织穿透能力较差,在血液和非瘤组织的清除速度较慢,从而导致相对较低的T/NT比值,而Fab由于没有Fc段,分子量为50Kd,是完整IgG的1/3,具有较好的穿透性和药代动力学特征,且能较好地保持结合抗原的活性,因此成为应用较多的一种基因工程抗体类型。Fab不能与细胞的Fc受体结合,从而减少了非特异性结合；由于没有Fc调节IgG的分解代谢,在体内半衰期短、周转快,有利于放射免疫成像检查肿瘤。和完整抗体相比,Fab没有抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC),可以作为载体分子用于疾病的影像诊断和靶向治疗。本研究利用课题组前期研究结果,将噬菌体抗体库中筛选出的抗Trop-2Fab基因的载体转化大肠杆菌,逐步优化表达和纯化条件,制备纯度较高的特异性的抗Trop-2抗体Fab片段；在分析抗Trop-2Fab抗体免疫学特性的基础上,在细胞水平评价其对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响；将抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素(DOX)偶联,评价其偶联前后对胰腺癌细胞的抑制作用。研究目的：1.建立人源抗Trop-2抗体Fab片段在大肠杆菌中表达的方法,优化蛋白表达及纯化的条件；2.抗Trop-2抗体Fab片段的免疫学特性的分析；3.在细胞水平上观察人源抗Trop-2抗体Fab片段对胰腺癌细胞增殖、侵袭与迁移的影响及相关的分子机制探讨；4.抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素的偶联,药物偶联后抗体的特性分析；5.比较抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联前后对胰腺癌细胞生物学特性的影响。研究方法：1.将抗Trop-2Fab抗体的表达载体转化宿主菌E.coli. TOP10F’,比较诱导前培养液更换对抗Trop-2Fab片段表达量的影响；比较不同诱导温度、诱导时间及诱导前加入葡萄糖对蛋白表达的影响；大量表达的抗Trop-2Fab经亲和层析纯化后,分别用免疫荧光和流式细胞术检测其免疫学特性。2.用MTT法检测抗Trop-2抗体Fab片段对两株胰腺癌细胞增殖的影响,根据实验结果,选择一种细胞系作为后续实验研究对象。利用伤口愈合实验,测定抗Trop-2抗体Fab片段对胰腺癌细胞迁移能力的影响；用Transewell法检测抗Trop-2抗体Fab片段对胰腺癌细胞侵袭能力的影响；3.通过化学合成法将抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联,用ELISA和直接免疫荧光分析偶联物(DOX-anti-Trop-2Fab)中抗体的特异性；用直接免疫荧光法观察DOX-anti-Trop-2Fab在胰腺癌细胞内的转运过程；4.用MTT法检测抗Trop-2抗体Fab片段及药物偶联抗体对胰腺癌细胞增殖的影响。研究结果：1.在培养液中加入5g/L的葡萄糖,人源抗Trop-2抗体Fab片段的表达量明显增加；16℃的诱导温度比其它温度能表达更多的Fab分子；加诱导剂诱导12小时,目的蛋白的表达量至峰值。FACS检测结果显示,抗Trop-2抗体Fab片段与表达Trop-2的胰腺癌细胞BxPc3的结合信号较强,而与不表达Trop-2的NIH-3T3细胞的结合信号较弱；细胞免疫荧光检测结果表明,抗Trop-2抗体Fab片段能够与BxPc3细胞结合,阳性信号主要显示在细胞膜上,而阴性对照细胞NIH3T3基本没有信号。以上结果表明抗Trop-2Fab抗体片段能够特异性结合于胰腺癌细胞BxPc3的细胞膜上的天然构象Trop-2蛋白。2.MTT检测结果表明,人源抗Trop-2抗体Fab片段能够抑制人胰腺癌细胞的生长；伤口愈合实验表明,人源抗Trop-2抗体Fab片段能够抑制胰腺癌细胞的迁移；Transewell实验结果表明,人源抗Trop-2抗体Fab片段能够抑制胰腺癌细胞的侵袭。但是抗Trop-2抗体Fab片段只有在200ug/ml-400ug/ml的高浓度下,才能明显抑制胰腺癌细胞的增殖。3. ELISA结果表明,抗Trop-2抗体Fab片段药物偶联后的抗原结合能力无明显改变；细胞免疫荧光和FACS检测结果表明,DOX-anti-Trop-2Fab能够与胰腺癌细胞结合,阳性信号主要存在于细胞膜上,而阴性对照细胞NIH3T3基本没有信号。结果表明,抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联后,能够特异性结合于胰腺癌细胞膜上的天然构象Trop-2蛋白。免疫荧光观察胰腺癌细胞内的转运过程表明,DOX-anti-Trop-2Fab与阿霉素相比,DOX-anti-Trop-2Fab在细胞内的转运虽有一定的滞后性,但4小时后,细胞内的阳性信号无明显区别。4.体外实验结果表明,DOX-anti-Trop-2Fab对胰腺癌有明显的抑制作用且优于游离抗体和阿霉素。MTT结果表明,DOX-anti-Trop-2Fab对细胞增殖的抑制在药物作用后72小时,抑制率已近90%,而相同浓度的阿霉素在相同的实验条件下对胰腺癌细胞的抑制率仅75%,游离的抗Trop-2抗体Fab为55%,这说明抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联后能够有效提高抗Trop-2抗体Fab片段和阿霉素对胰腺癌细胞的抑制作用。研究结论：1.优化表达和纯化条件后抗Trop-2抗体Fab片段的纯度和产量都明显提高,且保持其免疫学特性；2.高浓度抗Trop-2Fab可抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移；3.抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联后其结合能力和特异性无明显改变；4. DOX-anti-Trop-2Fab可明显抑制胰腺癌细胞的增殖,且疗效优于游离阿霉素。用药后72小时,DOX-anti-Trop-2Fab对胰腺癌细胞的抑制率已近90%,而相同浓度的阿霉素对胰腺癌细胞的抑制率仅75%,游离的抗Trop-2抗体Fab的抑制率为55%。