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花生四烯酸脂氧酶途径的代谢产物半胱氨酰白三烯在心脏、血液动力学、微循环的病理生理学中有重要影响，亦是重要的炎症介质。白三烯LTB4、C4、D4和E4等可在心脏缺血时产生，引起血管痉挛和血管通透性增高，进而导致心肌梗死和缺血性损伤。曾有报道脂氧酶抑制剂BXY x1005，可减少细胞来源的白三烯合成，减小心肌坏死面积，降低死亡率。半胱氨酰白三烯通过其特异性受体发挥作用。这些结果提示白三烯受体拮抗剂可能对心肌缺血性疾病有益处。孟鲁司特钠（Montelukast，Mon）是半胱氨酰白三烯受体1（Cys-LT1）的特异性拮抗剂，可阻断LTC4、LTD4与Cys-LT1的结合，是新型非甾体类抗炎药。作为白三烯受体拮抗剂的代表药物，Mon在心血管系统中是否存在有益作用，国内外尚未见报道。本实验旨在观察预先给予孟鲁司特钠对异丙肾上腺素所致的心肌损伤是否具有保护作用，并围绕NF-κB及其下游基因ICAM-1以及NOS展开研究，探讨孟鲁司特钠的相关作用机理。 浙江大学搏士学位论文Monlo、Mon30组捆 l一 d佣赡g给药 Mon 3ITlg．kg－‘．d‘、10 p．kg－‘．d‘、30 mg·kg－‘·d－‘。ex骗 3d和第4d每天腹腔注射ex 2 p．kg’。除正常对照组外，其余 5组在 d3、d4每天上午皮下注射 Iso 2 mg．kg’，制备心肌坏死模型。全部大鼠于末次注射 Iso 24h后，戊巴比妥钠麻醉门0 mg上g－‘)，腹主动脉取血，取。O脏作下述测定。2．2 生化指标检测 收集血液，分离血清，用酶速率法在Becklnan LX20全自动生化分析仪上测定门冬氨酸氨基转移酶（AST人 乳酸脱氢酶（LDH人 肌酸激酶（CK）含量。用硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量。取大鼠心脏，匀浆、离心后取上清，用硝酸还原酶法测定NO 的转化产物（NO／MO。）代表心肌NO水平。2．3 心肌病理形态学检查 大鼠处死后，切除心脏置10％中性缓冲福尔马林液中固定。平行于心脏房室间沟将心脏横切4块，常规固定、脱水、包埋，制作spin组织切片，HE染色，即每个心脏四张切片，在显微镜下以 OlylnpUS CCD数码相机将图片输人计算机，用MIAS99图象分析系统和自行设计计算机软件，参照逐区点测量法求出各组大鼠。卜肌坏死面积。同时，按照Rona标准，将心肌病理损伤分为四级，观察各组心肌损伤程度。2刀 iNOS、eNOS、nNOS和 NF－。B P65赃组织化学检测 大鼠心脏制成石蜡包块，切取spin厚切片，按链霉素亲和素－生物素 旧ABC法）分别进行 WOS、eNOS、＂NOS和 P65蛋白免疫组化染色。所用一抗均为兔抗大鼠多克隆抗体即用型。DAB溶液显色，同上将图片输人计算机，分别用阳性细胞数、灰度值法两种方法判断免疫组化实验结果。2·5 Western Blot检测 I。B a蛋白 取100mg心肌组织，提取胞浆总蛋白。Folin－酚试剂法测定样本蛋白浓度。取总蛋白20pg，SDS－PAGE凝胶电泳分离蛋白片段，将凝胶上 2 浙江大学博土学位论文的蛋白多肽电泳转移至固相支持物硝酸纤维素膜。在膜上靶蛋白与兔抗大鼠互。B a多克隆一抗、辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗的结合，ECL试剂温浴，暗室X光片曝光显影。免疫印迹X光片经凝胶成像系统摄像分析，以 BIO卫AD Quantity刀ne 4＊刀软件系统采集数据，测定条带光密度值和面积，两者乘积即为信号条带的积分吸光值。2石半定量 RT·PCR检测 ICAM－lmRNA 取 10Omg心肌组织用 TRIzol试剂提取细胞总 RNA，紫外光度仪测定总RNA浓度。取定量总 RNA旧）50 pl体系逆转录合成 CDNA第一链。取定量 CDNA模板旧)加人靶基因 ICAMJ上下游引物，25pl体系行 PCR反应。ICAM－l上游序列为：5’－GATGCTGACCCTGGAGAGCA－3’；下游序列为：5－CAGGGACHCCCATCCACCT．3’。扩增条件为：940C X 3而n预变性；94’C X 30see变性，55‘C X 30see退火，72’C XI dn延伸：36个循环后再延伸sndn。以p－actin为内参照。PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用凝胶成像仪观测结果，ICAM－IPCR产物与内参照的荧光密度比作为ICAM－l基因的相对表达含量。2．7 统计学分析 数据以均数士平均数表示，采用 SPSS 0刀统计软件包，采用单因素方差分析、Ridit分析、配对资料t检验作差异的显著性比较。以P＜0刀5为差异具有显著性意义。 结 果3．1 生化指标检测结果 ISO造成心肌损伤后，模型组LDH、CK活性升高，LDH较正常组升高约4倍，CK高于正常组约1．5胀血清AST指标无明显变化。血清MDA水平升高至止常3倍左右。心肌NO亦较正常有所增加，但差异无统计学意义。 3 浙江大学博士学位论文给予MOlllo、30mg．kg’及eX后血清LDH、CK、MDA活性均有明显下降。Mon 30组。乙肌 NO含量为 759．2土 205．3 runol?