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圆斑星鲽(Verasper variegates)俗称花斑宝,属脊索动物门(Chordata)、硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲽形目(Pleuronectiformes)、鲽科(Pleuronectidae)、星鲽属(Verasper),是一种冷温型的大型底栖鱼类,分布于我国北部的黄渤海和东海,具有食性范围广、生长速度快、抗病能力强、营养价值高、口味鲜美等特点,是优良的养殖品种。圆斑星鲽在生长过程中雌性个体的生长明显快于雄性个体,同龄的雌雄个体大小相差悬殊。鱼类性别决定机制研究有助于推动单性繁育技术的深入开展,目前,圆斑星鲽性别决定和生殖调控的分子机制仍不清楚,相关研究较少。本文开展了圆斑星鲽性别相关基因的克隆与表达分析,扩增了piwil2、wt1、cyp19a1b和amh的全长,分析了它们的时空表达情况,为解析圆斑星鲽性别决定的分子机制提供了重要参考。1.圆斑星鲽piwil2基因的克隆与表达分析采用RACE末端扩增方法,得到全长3872bp的圆斑星鲽piwil2基因序列,命名为Vvpiwil2,开放阅读框(ORF)长3192bp,编码1063个氨基酸,5’-UTR和3’-UTR分别长140 bp和540bp。基于Ex PASy、SMART、Signal4.1和NCBI的保守结构域(CDD)数据库在线分析对蛋白序列结构进行预测,推断Vvpiwil2基因编码的氨基酸分子量为118.6k Da,理论等电点为9.02,无跨膜结构及信号肽,有3个结构域:Argo L1结构域、PAZ结构域及PIWI结构域。利用实时荧光定量PCR技术对圆斑星鲽不同发育时期的胚胎、仔稚鱼以及雌雄成鱼的不同组织表达模式进行分析,结果表明:Vvpiwil2基因从胚胎发育早期至高囊胚期均大量表达,之后呈下降趋势,直至孵化阶段。由于胚胎从卵裂至囊胚时期的发育过程主要受细胞质成分引导,直至原肠早期,mRNA开始大量转录合成,实现由母源型向合子型的过渡,因而推断Vvpiwil2基因是母源性基因。孵化后仔稚鱼68d时Vvpiwil2基因的表达量显著高于其它时期,表明Vvpiwil2基因的功能可能与圆斑星鲽性腺分化过程相关;Vvpiwil2基因在雌雄成鱼性腺中的表达量显著高于其它组织,且卵巢中的表达量显著高于精巢,推测Vvpiwil2基因在卵巢功能的维持中发挥重要作用。本研究结果为解析圆斑星鲽性别决定机制提供了新的靶标基因,为建立全雌化苗种繁育技术打下坚实的理论基础。2.圆斑星鲽wt1基因的克隆与表达分析本研究获得了Vvwt1a及Vvwt1b两个同源基因,Vvwt1a基因全长为3263bp,预测开放阅读框(ORF)长为1245bp,编码415个氨基酸,5’-UTR和3’-UTR分别长372 bp和1640bp;Vvwt1b基因全长为2312bp,预测开放阅读框(ORF)长为1281bp,编码427个氨基酸,5’-UTR和3’-UTR分别长369bp和659bp。Vvwt1a基因编码氨基酸分子量为46.2KDa,理论等电点为9.24,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,编码KTS三肽;Vvwt1b基因编码氨基酸分子量为46.95KDa,理论等电点为8.99,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,并且编码KTS三肽。基因表达结果表明:Vvwt1a和Vvwt1b基因主要在圆斑星鲽性腺中表达,精巢的表达高于卵巢,肾脏的表达量显著高于其它组织,推测Vvwt1a基因和Vvwt1b基因在性腺和肾脏发育过程及功能方面均发挥重要作用;在早期发育阶段,Vvwt1a基因在原肠期之前微弱表达,从原肠早期开始逐渐上升至神经胚期表达量达到最高,之后逐渐下降,直至孵化阶段,推测Vvwt1a基因在圆斑星鲽原始生殖细胞分化过程及性腺发育中发挥重要作用。3.圆斑星鲽cyp19a1b基因的克隆与表达分析本研究采用RACE末端扩增方法通过cyp19a1b基因的克隆,得到cyp19a1b基因全长为1748bp,将其命名为Vvcyp19a1b。经预测开放阅读框(ORF)长为738bp,编码245个氨基酸,5’-UTR和3’-UTR分别长394 bp和615bp。经过生物学分析,推断Vvcyp19a1b基因编码的245个氨基酸分子量为27.55k Da,理论等电点为6.31,推断Vvcyp19a1b基因具有I-螺旋区、特异芳香化酶保守区、Ozol’s区及血红素结合保守区。研究Vvcyp19a1b基因在胚胎发育不同发育阶段中的表达量,结果显示其表达量从囊胚期开始上升,至神经胚期达到最高值,之后开始呈下降趋势,直至孵出阶段,表明cyp19a1b基因在圆斑星鲽神经系统发育中起重要作用;研究Vvcyp19a1b基因在仔稚鱼不同发育时期中的表达量,结果显示68d时其表达量显著高于其它组织,该基因对鱼类的性别分化也起到一定作用;Vvcyp19a1b基因在雌雄成鱼在所取组织中均有不同程度表达,脑组织中的表达量均显著高于其它组织,且雌性脑组织的表达量高于雄性脑组织,推测Vvcyp19a1b基因既可以参与鱼类脑组织中雌激素的合成,也可以调控性别决定与分化等生理活动。4.圆斑星鲽amh基因的克隆与表达分析本研究用RACE方法获得了圆斑星鲽amh基因全长,将其命名为Vvamh基因。生物信息学分析显示Vvamh基因开放阅读框(ORF)长为1434bp,编码478个氨基酸。其中第1～20个氨基酸为信号肽序列,第36～387个氨基酸为AMH-N区域,第404～469个氨基酸为TGF-β保守区。研究Vvamh基因在仔稚鱼不同发育时期中的表达量,结果显示Vvamh基因在68d时的表达量显著高于其它组织,推测该基因有抑制雄性性腺分化发育为雌性性腺的功能;通过实时荧光定量PCR研究Vvamh基因在雌雄成鱼各个组织的表达量,结果显示Vvamh基因在所取组织中均有表达,其中性腺组织中的表达量均显著高于其它组织,且在精巢组织中的表达量显著高于卵巢组织,我们推测Vvamh基因在精巢发育中发挥重要作用。此外amh基因在圆斑星鲽雌性性腺中也有较高的表达,表明该基因在卵巢中也发挥一定作用。