论文部分内容阅读
目的:通过建立结肠癌裸鼠种植瘤模型,给与COX-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib),检测结肠癌裸鼠种植瘤中细胞Wnt信号通路中的枢纽分子β-连环素(β-catenin)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor. VEGF)的表达情况,检测微血管密度(Microvessel density. MVD);研究塞来昔布对结肠癌裸鼠种植瘤中β-连环素(β-catenin)、血管内皮生长因子(VEGF)及微血管密度(MVD)的影响。检验塞来昔布抗肿瘤效果,探讨其抗肿瘤的部分机制,为将来临床应用COX-2抑制剂提供前期准备工作。方法:购买4～5周龄BALB/c雌性裸小鼠30只,体重20～24克,于无特定病原体(specified-pathogens free,SPF)环境下饲养,环境温度、湿度适宜,无菌饲料及灭菌纯净水饲养。使用含10%新生牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的D/F12培养基,在37℃含5%CO2培养箱中培养人结肠癌细胞株HT-29。取处于对数生长期的HT29细胞,用培养基配置成细胞密度为1×107/ml的细胞悬液。裸鼠皮肤消毒后用1ml注射器在颈部右侧皮下接种上述细胞悬液0.2m1建立种植瘤模型,定期观察,游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b),按公式V=ab2/2,计算肿瘤近似体积,16天后,肿瘤平均直径达5mm,将裸小鼠随机分为2组(塞来昔布组,对照组),塞来昔布组给予塞来昔布混悬液40mg/kg/d,用小号灌胃针灌胃给药,对照组不予处理。给药过程中注意抓持裸小鼠方法,固定小鼠,防治灌胃时小鼠挣扎,灌胃针损伤小鼠。SPF环境下继续饲养40天,每周测量小鼠的体重及肿瘤的体积,计算抑瘤率,给药40天后,颈椎脱臼处死小鼠,切取种植瘤组织,部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,常规包埋切片,进行免疫组织化学检测。部分置于液氮中冻存备用。应用免疫组织化学方法观察COX-2、β-catenin的表达情况;通过免疫组织化学方法检测血管内皮标志性因子CD34来观察肿瘤中的微血管密度。应用RT-PCR方法检测肿瘤细胞中的VEGFmRNA的含量。各项指标均与对照组比较,应用SAS6.12统计软件行t检验。在塞来昔布组中,应用直线相关分析方法,分析各指标间有无相关性。结果:1、30只裸鼠均成瘤,成瘤率100%,成瘤时间为细胞种植后第5-11天。肿瘤细胞种植后第16天,肿瘤直径平均达5mm。实验结束切取瘤组织后,对裸鼠解剖未发现种植瘤肝转移。2、治疗结束后,种植瘤体积分别为:对照组1238±241mm3;塞来昔布组852±153mm3;塞来昔布能明显抑制人结肠癌裸鼠种植瘤的生长。塞来昔布组抑瘤率为32.54%。t检验显示,与对照组比较,塞来昔布组种植瘤生长缓慢(P<0.05)。3、COX-2阳性染色主要位于细胞胞浆,呈棕黄色弥漫性分布,对COX-2免疫组织化学染色切片进行积分光密度测定,与对照组比较,塞来昔布组COX-2表达明显降低(P<0.05);β-catenin阳性染色主要位于细胞胞膜/浆,呈棕黄色颗粒状,对β-catenin免疫组织化学染色切片进行积分光密度测定,与对照组比较,塞来昔布组β-catenin表达明显降低(P<0.05)。4、将RT-PCR产物经电泳分析,加入VEGF-mRNA引物的可见约178bp的扩增带,加入GAPDH引物可见231bp的扩增带,对两条带进行灰度分析发现,塞来昔布组VEGF-mRNA表达低于对照组,差别有统计学意义(P<0.05)。5、免疫组织化学染色后对微血管热区进行计数,塞来昔布组MVD值较对照组降低,差别有统计学意义(P<0.05)。6、塞来昔布组内指标比较显示: COX-2与VEGF-mRNA和MVD之间成正相关关系(r>0.9,P<0.05)。β-catenin与VEGF-mRNA成正相关关系(r=0.95,P<0.05)。结论:1、COX-2抑制剂塞来昔布明显抑制结肠癌裸鼠种植瘤的生长。2、通过抑制β-catenin的异常表达,减少经Wnt信号传导途径引起的细胞增殖,抑制肿瘤细胞生长。3、通过直接抑制肿瘤中VEGF的表达而减少微血管的数量,抑制肿瘤生长。4、通过抑制β-catenin的异常表达,减少对VEGF的诱导而间接减少微血管数量,进而抑制肿瘤生长。