目的:研究白花蛇舌草[Oldenlandia diffusa(Willd.)Roxb.,OD]、半枝莲(Sculellaria barbata,SB)及其药对对人胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的影响;考察相同药物不同溶剂提取物的作用差异,比较单药和对药的作用差异,比较配伍比例对药对作用的影响;检测分析白花蛇舌草及半枝莲的活性成分;分析两种中药抗胶质瘤细胞迁移、侵袭的药效机制。方法:本实验分为四部分:1.制备OD、SB及OD:SB 1:1、1:2、2:1比例药对提取物,检测提取物对U87细胞存活率的影响及UPLC(Ultra-performance liquid chromatography,超高效液相色谱)分析。在保证提取充分的前提下,固定提取时间、提取溶剂的量两个提取条件,将可能影响药效的影响因素:提取溶剂的种类、单药与药对、药对配伍的比例作为筛查的对象设计提取方案。采用加热回流提取的方法分别用水、40%乙醇、80%乙醇提取OD、SB以及按OD:SB 1:1、1:2、2:1比例配伍的药对,共制备15个提取物。利用MTT法对这15个中药提取物对胶质瘤细胞存活率的抑制作用进行比较筛查,选取药效最优的溶剂提取物及药对配伍比例,用于后续实验。建立UPLC检测方法,比较确定检测波长、流动相、酸等色谱条件,方法建立后对白花蛇舌草、半枝莲及其药对提取物进行UPLC色谱分析,比较单药和药对的色谱图,结合MTT结果进行谱效分析。2.考察OD、SB及其药对提取物对人胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的影响。以MTT法、活死细胞染色、流式细胞术检测0、0.5、1、2、4、8 mg/mL浓度的OD、SB及其药对提取物对人胶质瘤U251和U87细胞存活率及凋亡的影响。根据实验结果选择对细胞存活率无明显影响的浓度作为迁移、侵袭实验的药物工作浓度。以划痕、Transwell实验研究OD、SB及其药对对二维细胞迁移、侵袭的作用。采用微流控芯片细胞三维灌流培养进行三维细胞侵袭实验。3.采用液质联用 UPLC-Q-TOF/MS(Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry,超高效液相色谱-四级杆飞行时间-质谱)方法分析OD和SB提取物的化学成分。4.通过网络药理学的分析方法分析OD、SB抗人胶质瘤可能的活性成分、作用靶点及其作用机制。借助TCMSP等平台收集OD和SB各自含有的化学成分,以及每个成分的药动学参数,保留其中OB(Oral bioavailability,口 服吸收利用度)≥30%、DL(Drug likeness,药物相似性)≥ 0.18的化合物,作为筛选出来的有效成分。在TCMSP平台上进一步查找OD、SB有效成分的作用靶点;通过OMIM、TTD、GAD等数据库查找人胶质瘤相关治疗靶点,在Cytoscape平台上分别合成中药成分-作用靶点、疾病-相关治疗靶点网络关系图,在此基础上采用Cytoscape的Bisogenet或STRING数据库分析药物靶点与疾病靶点蛋白质相互作用(PPI)关系。STRING平台的分析结果包含了GO注释分析及KEGG通路分析。以Cytoscape作图则将相互作用的蛋白上传至DAVID数据库,得到类似分析结果。从中筛选出白OD、SB抗胶质瘤细胞迁移、侵袭的相关通路,解释其作用机制。结果:1.15个提取物的MTT实验结果显示:三种溶剂提取物对U87细胞增殖活力的抑制作用为:80%乙醇提取物>40%乙醇提取物>水提物;在三个药对配比中1:2药对作用最优。比较单药与对药的UPLC图谱,未发现明显的新成分吸收峰,但共有峰的信号强度各样品之间相差较大。与其他两个配比药对的图谱比较,1:2药对的共有峰信号强度最高,即成分含量相对较高,这与MTT实验中1:2药对作用优于其他药对的结果一致。据此,选择两味单药及其1:2配伍药对的80%乙醇提取物作为后续研究对象。2.MTT实验、活死细胞染色及流式凋亡实验证明,OD、SB及其1:2药对提取物对人恶性胶质瘤U87和U251细胞具有明显的降低细胞存活率及促凋亡作用(p<0.05),且均与药物浓度正相关。在≤2 mg/mL的低浓度水平,提取物对细胞存活率的影响不明显,因此我们选择OD、SB及其药对提取物≤2 mg/mL的浓度水平作为迁移、侵袭实验的药物浓度。划痕愈伤及Transwell实验证明在0.5、1、2 mg/mL浓度下,OD、SB及其药对提取物能够明显抑制人胶质瘤细胞的迁移能力,1:2药对能够在Transwell侵袭实验中显著抑制细胞的侵袭能力,在2 mg/mL浓度下,OD、SB能够抑制U87及U251细胞的侵袭(p<0.05)。微流控芯片细胞三维灌流培养侵袭实验结果显示OD、SB及其1:2配伍药对能够抑制人胶质瘤三维培养细胞的侵袭能力。3.以UPLC-Q-TOF/MS法检测表征OD、SB80%乙醇提取物,在正离子模式下,OD提取物检测出35个化合物,SB提取物检测出42个化合物,这些成分中包含了部分OD、SB抗胶质瘤迁移、侵袭的活性成分。4.采用网络药理学的方法分析OD、SB抗人胶质瘤迁移、侵袭的有效成分、作用靶点和相关机制。在TCMSP等平台收集中药成分,并根据OB、DL参数进行活性筛选,OD的38个组分中有24个符合要求,从SB的94个化学成分中筛选出29个活性成分,在此基础上整理了每个活性成分对应的作用靶点,通过检索多个疾病靶点数据库,挖掘整理了的72个人胶质瘤的疾病相关靶点,将数据输入Cytoscape平台,分别构建中药成分-靶点网络图、疾病-靶点网络图,然后分别与OD、SB的活性成分靶点构建两味中药的成分靶点-人胶质瘤疾病靶点蛋白质相互作用关系PPI网络图。将PPI网络图中的节点蛋白进行GO注释分析及KEGG通路分析,结果显示OD可能通过参与MAPK通路、Wnt信号通路及微管细胞骨架的调节抑制人胶质瘤细胞的迁移和侵袭;其降低胶质瘤细胞存活率、促凋亡的作用与参与调控细胞周期阻滞及细胞增殖负性调控、对内源性凋亡通路及促凋亡过程的干预以及P53经典调节相关。SB抗人胶质瘤细胞迁移侵袭作用机制可能与其对黏着斑、VEGF、MAPK信号通路的调控相关;此外半枝莲参与了PI3K-Akt、Jak-STAT、p53、Ras等信号通路及细胞周期的调节,这些生物学行为与SB降低胶质瘤细胞存活率、促凋亡作用有关。结论:中药OD和SB及其药对80%乙醇提取物对人胶质瘤细胞具有明显的抑制迁移、侵袭作用,并具有浓度相关的抑制细胞存活率、促凋亡活性。药对与单药的UPLC图谱比较没有发现明显的新物质吸收峰,说明药对的作用应是两味中药药效加和的结果。网络药理学研究显示OD对人胶质瘤细胞迁移侵袭的抑制作用可能与其对Wnt、MAPK通路及微管细胞骨架的调节有关,SB的抗人胶质瘤细胞迁移、侵袭的作用可能与其对黏着斑、VEGF、MAPK信号通路的调控相关。研究结果提示,OD、SB及其药对在本实验中表现出来的生物活性可能对人恶性胶质瘤的迁移侵袭与复发的治疗提供新的用药依据。