论文部分内容阅读
目的:1.基于网络药理学和分子对接技术探索益气活血方治疗脑缺血的潜在作用机制。2.基于中医“益气活血,通利玄府”理论,探索益气活血方对脑缺血再灌注后血脑屏障的调控作用,为后续分子机制研究提供实验基础,也为阐述“益气活血,通利玄府”理论提供实验依据。3.基于中医“益气活血,通利玄府”理论,探索益气活血方对脑缺血再灌注后EGFR/FAK/SRC/ZO-1信号通路的调控作用,为脑缺血治疗提供新思路,也为阐述“益气活血,通利玄府”理论提供实验依据。方法:1.基于TCMSP和CNKI数据库获取益气活血方活性成分;利用Pharmmapper数据库获得成分靶点信息;检索OMIM、Gene Cards、Dis Ge NET数据库得到脑缺血的疾病靶点;Venn图得到交集靶点,通过String数据库得到蛋白互作关系,Cytoscape可视化结果,插件MCODE获得核心靶点;使用Metascape数据库对核心靶点进行GO和KEGG通路富集分析;选取前20条KEGG通路富集通路用Cytoscape构建“成分-靶点-通路”图;根据中介中心性值选取排名前10的成分与前5的靶点信息,利用Auto Dock Vina软件进行分子对接验证,用Py Mo L、Ligplus软件可视化结果。2.SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组,每组分为3d、7d、14d三个时象。建立脑缺血再灌注模型,假手术组、模型组灌服等体积蒸馏水,中药组灌服等体积益气活血方。观察大鼠一般情况、大鼠脑组织形态,应用m-NSS评分法评价大鼠神经功能缺损程度,TTC染色计算脑梗死体积,依文思蓝染色检测血脑屏障通透性,苏木素伊红（HE）染色观察脑组织细胞的形态变化。3.SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组,每组分为3d、7d、14d三个时象。建立脑缺血再灌注模型,假手术组、模型组灌服等体积蒸馏水,中药组灌服等体积益气活血方。取脑组织进行荧光双标检测ZO-1/CD31;Western Blot检测脑缺血组织中EGFR、FAK、p-FAK、SRC、ZO-1蛋白表达;q T-PCR检测脑缺血组织中EGFR、FAK、SRC、ZO-1m RNA表达。4.小鼠脑微血管内皮细胞随机分为正常组、模型组、空白血清组、含药血清组、SRC抑制剂组,干预24h后进行荧光双标检测ZO-1/CD31;q T-PCR检测细胞EGFR、FAK、SRC、ZO-1 m RNA表达。结果:1.筛选得到益气活血方活性成分83个,相应靶点432个,疾病相关靶点2005个,药物与疾病的交集靶点140个;GO生物功能分析和KEGG通路富集分析得到507条生物功能条目及141条信号通路。KEGG通路富集分析主要参与细胞增殖、粘附、迁移等过程;分子对接结果显示,筛选的关键成分与核心靶点皆具备较强的结合活性,其中EGFR、SRC与丹参新酮Ⅰ、丹参酮二酚结合较为稳定。2.益气活血方对脑缺血再灌注模型大鼠血脑屏障的保护作用。结果显示:（1）一般情况:模型组大鼠精神及活动度差,进食、饮水量少,偏瘫症状明显。中药组精神、活动度、进食饮水、肢体偏瘫症状在各时间点均比模型组大鼠一般情况要好。在术后1d、3d、7d、14d,模型组较假手术组体重下降明显（p＜0.05）。同组大鼠比较术前与术后1d、3d、7d、14d,体重存在差异性（p＜0.05）。（2）脑组织形态:假手术组脑组织形态正常,无脑组织水肿,无梗死区域,表面供血动脉分布均匀。模型组术后3d右侧脑组织可观察到明显白色梗死区域,脑组织明显水肿,脑表面可见局部动脉充盈,在术后7d、14d,脑组织梗死面积有所减少,局限于额叶区域,脑组织呈现萎缩状态,遗留额叶病灶。中药组在术后7d梗死区域有所减少,以额叶区为主,术后14d额叶区遗留白色梗死灶,脑组织未见明显萎缩。（3）神经功能缺损评分:在3d、7d、14d三个时间节点,中药组评分较模型组均处于低值（p＜0.05）。中药组同组内14d评分低于7d、3d、2h组（p＜0.05）,中药组同组内7d评分低于3d、2h组（p＜0.05）,中药组同组内3d评分低于2h组（p＜0.05）。（4）脑梗死体积:中药组较模型组均表现为脑梗死体积的减少（p＜0.05）。中药组同组内14d脑梗死体积小于7d、3d（p＜0.05）,中药组同组内7d脑梗死体积小于3d组（p＜0.05）。（5）血脑屏障通透性:与假手术组相比,中药与模型组均出现明显的血脑屏障渗透率升高（p＜0.05）。模型组可见右侧额叶区、枕叶区明显蓝染改变。与模型组相比,同时象的中药组较之血脑屏障渗透率有所下降（p＜0.05）。与3d组进行对比,中药、模型组的7d、14d组出现一定的下降趋势（p＜0.05）。在14d,模型组血脑屏障渗透率仍明显高于假手术组（p＜0.05）,而中药组逐渐靠近正常值（p＜0.05）。中药组同组内14d血脑屏障通透性低于3d组（p＜0.05）。（6）HE染色:假手术组,未见细胞损伤,染色可见细胞结构完整,排列齐整,细胞分布、着色均匀。而模型、中药组均表现出明显的细胞损伤,模型组3d组损伤最为严重,可见细胞结构的断裂,局部呈现空泡样改变,细胞核固缩,染色质呈现边集,促使细胞着色加深,细胞组织染色不均,白色空泡区域与蓝黑色固缩细胞核夹杂,细胞分布杂乱无章,紧密与稀疏均可见。中药组较模型组,细胞损伤有所减轻,细胞空泡与固缩区域明显减少,细胞分布相对规整。计数细胞数目可见,在3d、7d、14d三大时象,中药、模型组较假手术均呈现减少趋势（p＜0.05）。对比中药组与模型组,中药组细胞数目明显较多（p＜0.05）。3.益气活血方对脑缺血再灌注大鼠EGFR/FAK/SRC/ZO-1信号通路的调控作用。（1）ZO/CD31免疫荧光双标:3个时象对比,模型ZO-1、CD31平均荧光强度明显弱于假手术组（p＜0.05）。与模型组对比,中药组ZO-1、CD31平均荧光强度在不同时象均高于模型组表达（p＜0.05）。同组内比较,中药、模型组14d、7d CD31平均荧光强度表达高于3d组（p＜0.05）,中药、模型组14d CD31平均荧光强度表达高于7d组（p＜0.05）。同时象对比,模型、中药组ZO-1/CD31共定位情况明显弱于假手术组（p＜0.05）,模型组3d组共定位散点图可见轻微内凹形态,共定位强度有所减弱。与模型组对比,中药组ZO-1/CD31共定位情况在不同时象均高于模型组表达（p＜0.05）。同组内比较,中药、模型7d组ZO-1/CD31共定位情况高于3d组（p＜0.05）,中药、模型14d组ZO-1/CD31共定位表达高于3d、7d组（p＜0.05）。（2）Western Blot检测脑缺血组织中EGFR、FAK、p-FAK、SRC、ZO-1蛋白表达:模型组EGFR、FAK、SRC蛋白表达较假手术组明显上升（p＜0.05）,ZO-1蛋白表达较假手术组下降（p＜0.05）。中药组EGFR、SRC蛋白表达高于假手术组（p＜0.05）。在3个时象组内对比,中药组p-FAK较模型组有所下降（p＜0.05）,中药组ZO-1蛋白表达较模型组有所上升（p＜0.05）。通过模型组与中药组组内时象对比,7d、14d的FAK蛋白表达高于3d组（p＜0.05）,7d的p-FAK蛋白表达高于3d组（p＜0.05）,p-FAK/FAK 14d组低于3d、7d组（p＜0.05）,14d组ZO-1的蛋白表达高于3d、7d组（p＜0.05）。（3）q T-PCR检测脑缺血组织中EGFR、FAK、p-FAK、SRC、ZO-1m RNA表达:模型组EGFR、SRC m RNA表达较假手术组明显上升（p＜0.05）,ZO-1蛋白表达较假手术组下降（p＜0.05）。中药组FAK m RNA在3d、14d低于模型组（p＜0.05）,在7d组高于模型组（p＜0.05）,中药组ZO-1m RNA在各时象均高于模型组（p＜0.05）。EGFR m RNA中药组表达在3d、14d低于模型组表达（p＜0.05）,在7d时较模型组升高（p＜0.05）。4.益气活血方对小鼠脑微血管内皮细胞EGFR/FAK/SRC/ZO-1信号通路的调控作用。（1）细胞存活率:对比不同浓度空白血清细胞存活率,10%空白血清组与模型组无明显差异。10%含药血清较5%的含药血清细胞存活率有所上升（p＜0.05）,5u M、10u M、20u M抑制剂组较模型组有所下降（p＜0.05）,15u M抑制剂组与模型组无明显差异。模型组较正常组细胞存活率明显下降（p＜0.05）,10%空白血清组、15u M抑制剂组与模型组无明显差异。10%含药血清组较模型组细胞存活率有所上升（p＜0.05）。（2）ZO/CD31免疫荧光双标:与正常组对比,模型组ZO-1,CD31平均荧光强度明显减弱（p＜0.05）。与模型组对比,含药组ZO-1,CD31平均荧光强度高于模型组表达（p＜0.05）。抑制剂组ZO-1,CD31平均荧光强度较模型组有所上升（p＜0.05）,但低于含药组（p＜0.05）。与正常组对比,模型组ZO-1/CD31共定位情况有所减弱（p＜0.05）,而含药组散点图可见长的棒槌状,较模型组有所上升（p＜0.05）。抑制剂组共定位散点图基本呈现线性分布,较模型组有所上升（p＜0.05）,较含药组有所下降（p＜0.05）。（3）q T-PCR检测细胞中EGFR、FAK、p-FAK、SRC、ZO-1m RNA表达:模型组较正常组EGFR、FAK、SRC m RNA表达均有上升（p＜0.05）,ZO-1 m RNA表达有所下降（p＜0.05）。含药血清组EGFR、FAK、SRCm RNA表达较模型组表达呈下降趋势（p＜0.05）,ZO-1 m RNA表达较模型组有所上升（p＜0.05）。抑制剂组EGFR、FAK、SRC m RNA表达较模型组下降（p＜0.05）,与含药组无明显差异。抑制剂组ZO-1m RNA表达较模型组上升（p＜0.05）,较含药组有所下降（p＜0.05）。结论:1.益气活血方活性成分丹参新酮Ⅰ、丹参酮二酚可与EGFR、SRC稳定结合,通过细胞膜上酪氨酸激酶受体向细胞内传导MAPK、PI3K/Akt等信号通路促进细胞增殖,通过黏着斑信号通路、Rap1、Ras信号通路参与细胞粘附与移动。2.益气活血方能够缓解脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损症状,缩小脑梗死体积,降低血脑屏障通透性,减缓缺血后脑组织损伤。3.益气活血方能通过下调EGFR、FAK、p-FAK、SRC等表达,从而促进ZO-1表达,起到脑保护作用。