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背景与目的:乳腺癌是女性的第一位好发肿瘤。早期诊疗效果较好,但一旦发生转移则严重影响患者的生存时间与生活质量。骨骼,特别是胸骨、脊柱是乳腺癌首要的转移部位,一旦发生骨转移则无有效治愈方法。目前乳腺癌骨转移的治疗方案一般采用姑息治疗或手术治疗,以改善症状为主,尚无治愈方法。乳腺癌骨转移后会导致一系列骨相关事件,包括病理性骨折、神经脊髓压迫、高钙血症、骨痛等,严重影响患者的生存时间与生存质量。乳腺癌骨转移后一般表现为溶骨性病变,但是乳腺癌细胞并不能直接引起溶骨。骨重塑依赖于成骨细胞所介导的成骨作用与破骨细胞介导的溶骨作用相互协调,乳腺癌骨转移破坏了正常的骨重塑平衡,进而引起溶骨性病变。在这过程中肿瘤细胞分泌多种因子调控成骨与破骨细胞的生理活动,目前已发现肿瘤可分泌RANKL、PThrP、TGF-?、IL等多种因子促进破骨细胞分化成熟及其介导的骨吸收,但肿瘤细胞对成骨细胞分化的调控作用尚不清楚。Semaphorin 4D(Sema 4D)是一类轴突引导生长因子,近年来发现其在肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达,与肿瘤的恶性进展密切相关。2011年日本学者发现小鼠破骨细胞可分泌Sema 4D调控成骨细胞的分化与迁移,在Sema 4D-/-小鼠成骨细胞分化与迁移能力增强,表明Sema 4D除了参与轴突引导、肿瘤进展等,还参与骨代谢调控。因此我们假设,乳腺癌来源的Sema 4D在乳腺癌骨转移所引起的成骨抑制及肿瘤进展中发挥重要作用。本课题通过shRNA干扰表达、Transwell共培养模拟乳腺癌骨转移微环境等方法,研究Sema 4D在乳腺癌骨转移中对乳腺癌细胞自身及成骨细胞分化的作用与可能机制,为乳腺癌骨转移防治提供新的理论基础。方法:1.通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹实验、细胞免疫荧光等方法检测Sema4D在乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞系的表达,筛选Sema 4D高表达细胞细胞系。2.sh RNA慢病毒转染Sema 4D高表达乳腺癌细胞系,嘌呤霉素筛选、扩增,实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹实验、细胞免疫荧光等方法确定干扰效率,建立稳定的Sema 4D低表达乳腺癌细胞系。3.通过CCK-8、Transwell迁移实验、划痕实验、FCM流式周期检测干扰Sema 4D表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞系增殖、迁移及周期的影响。4.通过Transwell共培养模拟乳腺癌骨转移微环境,应用实时荧光定量PCR、碱性磷酸酶染色、茜素红染色观察Sema 4D干扰前后乳腺癌细胞调控成骨前体细胞分化能力的变化,以明确Sema 4D在乳腺癌溶骨性骨损害中的作用。5.通过蛋白免疫印迹实验检测Transwell共培养下Sema 4D干扰前后乳腺癌细胞调控成骨前体细胞AKT、p-AKT表达的变化,确定Sema 4D作用的可能机制。结果:1.Sema 4D在高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中m RNA及蛋白表达表达均明显高于低侵袭性乳腺癌细胞系MCF-7;2.Sema 4D sh RNA转染后乳腺癌MDA-MB-231细胞Sema 4D m RNA及蛋白表达水平明显降低,成功建立Sema 4D干扰表达乳腺癌细胞模型;3.干扰Sema 4D表达可明显抑制乳腺癌细胞系的增殖、迁移及细胞周期;4.乳腺癌细胞与成骨细胞共培养体系中,乳腺癌细胞可明显抑制成骨前体细胞的分化,干扰Sema 4D表达后,乳腺癌细胞系对成骨分化的抑制效应明显减弱;5.乳腺癌细胞明显抑制成骨前体细胞AKT的磷酸化水平,沉默Sema 4D表达后,成骨前体细胞AKT磷酸化表达水平明显增高。结论:1.Sema 4D在高侵袭性乳腺癌MDA-MB-231细胞系中高表达;2.Sema 4D sh RNA可有效干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞Sema 4D表达;3.Sema 4D可促进乳腺癌细胞增殖、迁移及细胞周期,在促进乳腺癌恶性进展中发挥重要作用;4.干扰Sema 4D表达后,乳腺癌细胞对成骨细胞分化的抑制效应减弱,Sema 4D在乳腺癌抑制成骨分化效应中发挥部分作用;5.乳腺癌来源的Sema 4D可能通过下调AKT磷酸化,进而抑制成骨细胞分化。