论文部分内容阅读
狗牙根(Cynodonspp.)是最重要的暖季型草坪草之一，其根系发达、繁殖力强、耐践踏、色泽佳，因而被广泛用于热带亚热带地区运动场、公园、公共绿地及护坡等。三倍体狗牙根不能进行种子繁殖，限制了对其传统杂交育种的改良，因而利用细胞工程和基因工程等现代生物技术手段对现有品种进行改良显得尤为重要和必要。狗牙根生物技术育种的研究目前还处于起步阶段。本研究从探讨几种草坪草抗旱性差异和抗旱机理入手，以Tifeagle(CynodondactylonxC.transvaalensis)为材料，首先建立Tifeagle的高效组织培养再生体系，在此基础上通过对离体培养组织进行长时间的连续悬浮继代培养以诱发体细胞无性系变异。然后，一方面直接从再生植株中筛选变异体。另一方面以NaCl作为选择压力，从中筛选耐盐的细胞系，进而再生出耐盐的狗牙根变异体。另外，还利用基因枪法将抗旱耐盐的基因CMO和BADH转入Tifeagle的愈伤组织中，获得转基因植株，并对这些植株的抗旱、抗盐性进行了初步鉴定。主要获得以下实验结果：
1.草坪草的抗旱性及化学调控
在停止浇水造成土壤逐渐干旱的过程中，矮生狗牙根RWC降低幅度最小，电导率升高慢，表明其耐旱性最强；沟叶结缕草次之，而地毯草对干旱反应最敏感，耐旱性最弱。在干旱的过程中，耐旱性弱的地毯草的脯氨酸积累量最大，矮生狗牙根的脯氨酸积累较少，脯氨酸的积累与植物受伤害的程度成正相关，说明干旱条件下草坪草积累脯氨酸是植物对干旱伤害的生理反应。矮生狗牙根和沟叶结缕草具有较强的耐旱性与它们在干旱条件下能维持较高的清除H2O2的酶活性(POD、CAT)有关；地毯草对干旱敏感，它在干旱条件下SOD活性提高，而清除干旱产生的H2O2的酶活性较低，造成植物受到严重伤害。ABA和S3307都能改善干旱条件下3种草坪草的水分状况，提高其抗旱性，其中以ABA的效果最明显。ABA处理提高了矮生狗牙根SOD、CAT和POD活性，因而能提高其抗旱性。
2.建立狗牙根组织培养再生体系的研究
以三倍体杂交狗牙根Tifeagle的匍匐茎节为外植体，较系统地探讨胚性愈伤组织诱导、继代、再生的条件。最后确定适宜的诱导培养基为：N6大量元素，B5或MS微量元素，MS铁盐，GamborgsVitamin(Sigma)成分为基本培养基，附加Dicamba6.6mg/L、BA0.6mg/L、水解乳蛋白0.5g/L、谷氨酰氨0.5g/L、脯氨酸0.5g/L、肌醇0.1g/L、蔗糖30g/L、琼脂7g，培养基灭菌前调至pH5.8。在此固体培养基上产生的胚性愈伤转移至液体培养基上悬浮继代(液体悬浮继代培养基激素成分与诱导培养基相同，只是不加琼脂，无机微量成分改为选用MS)，摇床转速控制在20-30r/min。适宜的分化培养基是将诱导培养基中的Dicamba去掉，其它成分完全相同。采用上述系统可以获得大量的愈伤组织，且愈伤的再生率可以高达90％以上。另外，借助光学组织切片和扫描电镜观察，揭示体细胞胚胎发生是Tifeagle茎节离体培养组织的一种再生方式。
3.狗牙根体细胞无性系变异体的筛选及初步鉴定
在已经建立起的狗牙根高频再生系统的基础上，从连续继代18个月以上的138团愈伤组织再生出近500株植物，剔除生长慢、没有应用前景的植株后，从余下约300株中观察到植株形态发生了明显变异，筛选出几个株系在夏季和春季均有较快的匍匐生长速度，如编号为11-01、13-03、16-04、39-02和80的株系，而编号为15-03、24、57-01、89-02和119-09的株系在不同年份的越冬过程中多次获得了较高的得分。这些株系值得进一步扩大试验，并最终形成品系和品种。研究结果同时也说明，通过对狗牙根愈伤组织进行长时间连续继代悬浮培养能有效地诱导体细胞变异，并能从再生植株中筛选出有益的性状。
4.狗牙根矮化变异体
对从再生植株中筛选出的一株矮化变异体(TV4)及其亲本Tifeagle进行了形态和抗逆性特征的比较测定。结果显示，与亲本Tifeagle相比，TV4匍匐茎节和叶片长度都变短，叶宽增加。虽然二者的叶绿素含量差异不大，但由于变异体TV4植株矮化，节密集，因而草坪密度更大，颜色比Tifeagle浓绿美观。TV4在次生根生长方面也显示出一定的优势，早期(20d)根数比亲本少，但主根长更长，后期(40d)不仅根长比亲本长，根数也明显增多，根系干重明显高于亲本，表明TV4根系更发达，这样的性状有利于增强植物的抗旱性。综合而言，矮化变异体TV4具有矮化、密度大、根系发达的特点，其耐冷性略有提高，是一个很有应用潜力的新株系。
5.狗牙根耐盐变异体的筛选及生理鉴定
在已建立狗牙根高频再生系统的基础上，以0.3mol/L的NaCl作为选择压力，采用间歇筛选法，从悬浮继代18个月以上的愈伤组织中筛选耐盐的细胞系，并进而再生出耐盐的狗牙根变异植株。对这些变异体进行了耐盐性测定，结果表明，50％株系的耐盐性高于亲本。测定了TE和耐盐变异体在正常和盐胁迫条件下的Na+/K+比、脯氨酸含量、可溶性糖含量和部分抗氧化酶活性，结果显示，不同耐盐株系的几个指标变化趋势不尽相同，表明不同株系可能具有不同的耐盐机理，但所有耐盐株系在正常生长条件下的脯氨酸含量均高于亲本，而Na+/K+比低于亲本，这可能是它们具有耐盐性的共同原因。
6.狗牙根的遗传转化、转基因检测及抗逆性鉴定
以Ubi启动子控制基因的表达，构建了BADH和CMO的表达载体：pAHC-Ubi-CMO、pCAM-Ubi-BADH和pBI-Ubi-CMO-Ubi-BADH，分另以bar、hph、nptⅡ为选择标记。采用基因枪转化，将这3个表达载体分别转入狗牙根愈伤组织，以Basta、潮霉素和G418进行抗性选择，获得了Basta或抗生素抗性再生植株。对这些再生植株进行了PCR检测，筛选出了阳性植株。对部分PCR阳性植株的PCR产物进行PCR-Southern杂交，均出现杂交信号，表明所扩增的为CMO或BADH基因片段。对转BADH植株进行了Southern杂交分析，3个编号的植株出现了多条杂交信号，证明基因以多拷贝方式整合到狗牙根基因组中。同时观察到B040与B042的杂交信号相同，说明它们可能是最初来自同一抗性细胞的相同植株。对部分转基因植株进行了耐盐性和耐旱性分析，结果表明，一些转基因株系大大提高了耐盐性和耐旱性，值得进一步培育成新品系或品种。