研究背景与目的下腰痛是骨科常见症状,约80%的人一生中会经历下腰痛。下腰痛已成为影响人类健康的主要问题,一系列调查表明：在西方工业社会,12%～35%的人患有下腰痛,其中10%已丧失劳动能力,美国最新统计显示,因下腰痛造成的直接医疗支出和间接损失保守估计为每年196亿美元,给社会医疗带来沉重负担。椎间盘退行性变是引起下腰痛的主要原因,它与坐骨神经痛和椎间盘突出、脱垂等疾病关系密切。但目前尚无逆转或延缓椎间盘退行性变的方法应用于临床,现行治疗方案主要针对退行性变晚期、症状明显患者实行对症治疗,其效果尚不能令人满意。椎间盘退行性变的确切机制还有待研究,但主要是由于机械、营养、生物等各种因素造成损伤,导致椎间盘细胞因子减少,炎症介质增多、基质金属蛋白酶和其他蛋白水解酶含量及活性增加,引起细胞外基质降解,髓核细胞数目减少,进而使蛋白多糖、胶原的合成减少,椎间盘类软骨细胞赖以生存的内环境被破坏,不能维持椎间盘内应有的张力,从而导致椎间盘的退行性变。加之椎间盘是一封闭结构,营养供应差,退行性变很难自行修复。鉴于椎间盘退行性变机制及椎间盘的生物学特性,通过细胞因子直接注射或基因转染增加细胞外基质合成、抑制其降解从而阻止或逆转椎间盘退行性变的研究越来越多,现已发现一些因子及其相应的基因对逆转这个过程是有益的。第1类为抗分解代谢细胞因子,如肿瘤坏死因子拮抗剂,白细胞介素1受体拮抗剂；第2类为促细胞分裂素,如胰岛素生长因子,生长分化因子,血管内皮生长因子等；第3类为骨诱导形成素,如转化生长因子β和骨形态发生蛋白；第4类为细胞内调节因子,如骨诱导蛋白1和软骨特异性基因Sox9。本研究通过对人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞的培养及生物学性状比较分析,观察其生物学特性,为研究椎间盘退变机理,椎间盘组织工程学,基因治疗等提供理论基础。通过根据前期学者相关研究结果,本课题选择了以下17种因子基因(合成代谢因子：BMP7、BMP14、BMP4、EGF、PDGF、BMP2、TGF-β、IGF1、bFGF、TIMP1、SOX9。分解代谢因子：MMP3、IL1、INOS。细胞外基质：COLLAGENI、COL2A1、AGGRECAN),探讨它们在人正常和退变椎间盘细胞中表达量的异同,选出差异较明显的基因作为体外退变髓核细胞的刺激因子,以期逆转椎间盘退变。第一部分：人正常与退变椎间盘髓核细胞的培养及生物学性状比较析目的：通过对人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞的培养及生物学性状比较分析,观察其生物学特性,为研究椎间盘退变机理,椎间盘组织工程学,基因治疗等提供理论基础。方法：通过分离、培养人正常和退变椎间盘髓核细胞,对2种细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,采用生长曲线和XTT实验研究2种细胞的生长动力学差异,测定髓核细胞的活力和细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达。ELISA检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原含量,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖含量。结果：退变椎间盘细胞至少要比正常椎间盘细胞提前2代出现形态学老化表现。退变髓核细胞表现为G1期阻滞,使细胞不能进入S期,细胞有丝分裂受到抑制。退变髓核细胞总体来说,生长要比正常髓核细胞快,但老化也较快。退变髓核细胞自第一代开始,Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达比同期正常髓核细胞低得多。说明在体外培养条件下,退变髓核细胞持续增殖能力低,更容易衰老、凋亡。结论：成功培养了人正常与退变纤维环细胞、髓核细胞,并进行两者的生物学比较测定,得出传2代之前的正常髓核细胞可以作为组织工程的种子细胞,退变髓核细胞体外培养衰老较快,进行干预试验逆转椎间盘退变的最佳时机为传2代之前的细胞。为椎间盘组织工程学,基因治疗等提供理论基础。第二部分：正常与退变椎间盘髓核细胞相关基因表达的研究目的：根据前期学者相关研究结果,本实验选择了以下17种因子基因(合成代谢因子：BMP7、BMP14、BMP4、EGF、PDGF、BMP2、TGF-β、IGF1、bFGF、TIMP1、SOX9。分解代谢因子：MMP3、IL1、INOS。细胞外基质：COLLAGENI、COL2A1、AGGRECAN),研究它们在人正常和退变椎间盘髓核细胞中表达量的异同,选出差异较明显的基因作为体外退变髓核细胞的刺激因子,以期逆转椎间盘退变。方法：荧光定量PCR(SYBR Green)技术检测人正常和退变髓核细胞TGFβ、IGF1、bFGF、IL1、TIMP1、COLLAGENI、COL2A1、AGGRECAN、MMP3、INOS、BMP2、BMP7、BMP14、BMP4、EGF、PDGF、SOX9的mRNA表达水平。结果：正常髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖、BMP-2、TGF-β、IGF-1、EGF、PDGF、SOX-9基因表达量均比退变髓核细胞高,退变髓核细胞Ⅰ型胶原、bFGF基因含量高于正常髓核细胞。bFGF基因在退变髓核细胞中含量较正常髓核细胞中含量高,BMP-2基因在正常髓核细胞中高表达,而在退变髓核细胞中表达阴性。以上差别均具有统计学意义。结论：通过人正常与退变髓核细胞以下17种因子基因(合成代谢因子：BMP7、BMP14、BMP4、EGF、PDGF、BMP2、TGF-β、IGF1、bFGF、TIMP1、SOX9。分解代谢因子：MMP3、IL1、INOS。细胞外基质：COLLAGENI、COL2A1、AGGRECAN)表达量的研究,得到bFGF在退变的髓核细胞中基因表达量高于正常髓核细胞,BMP-2在正常髓核细胞中高表达,退变髓核细胞BMP-2阴性表达。因此,可以选择这两种生长因子作为退变髓核细胞的刺激因子,探讨退变髓核细胞对两种极端表达因子的反应。第三部分：BMP-2对人退变椎间盘髓核细胞影响的实验研究目的：探讨BMP-2对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响,观察正常髓核细胞高表达而退变髓核细胞表达阴性的生长刺激因子对退变髓核细胞的影响。方法：分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变椎间盘髓核细胞分为2组。A组：加入100ng／mlBMP-2,B组：加入200ng／mlBMP-2,C组：对照组,不加干扰因素。通过对试验组和对照组髓核细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达。ELISA检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原含量,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖含量。结果：BMP-2刺激退变髓核细胞,髓核细胞中Ⅱ型胶原、糖胺多糖、Sox-9mRNA表达水平分别为空白组(7天)：1.0±0.103,1.0±0.043,阴性。BMP-2(100ng／ml,7天)：6.88±0.73,2.0±0.06,0.046±0.0062。BMP-2(200ng／ml,7天)：8.55±1.23,4.42±0.15,0.072±0.004。髓核细胞细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量分别为：空白组(7天,μg／L)：15.46±1.26,26.16±1.41。100ng／ml BMP-2(7天,μg／L)：44.36±2.08,34.57±2.16。200ng／ml BMP-2(7天,μg／L)：56.83±5.88,38.10±1.50。髓核细胞中Ⅱ型胶原、糖胺多糖、Sox-9mRNA表达水平分别为空白组(14天)：1.0±0.25,1.0±0.035,阴性。BMP-2(100ng／ml,14天)：2.04±0.18,7.30±0.72,0.071±0.00067。BMP-2(200ng／ml,14天)：8.19±0.43,2.08±0.156,0.1003±0.0121。髓核细胞细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量分别为：空白组(14天,μg／L)：20.19±2.08,30.49±2.29。100ng／mlBMP-2(14天,μg／L)：53.24±3.21,46.56±1.93。200ng／ml BMP-2(14天,μg／L)：78.38±2.70,45.73±2.21。髓核细胞中Ⅱ型胶原、糖胺多糖、Sox-9mRNA表达水平分别为空白组(21天)：1.0±0.133,1.0±0.035,阴性。BMP-2(100ng／ml,21天)：8.70±0.33,2.76±0.14,0.122±0.011。髓核细胞细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量分别为：空白组(21天,μg／L)：25.42±1.76,35.71±2.48。100ng／ml BMP-2(21天,μg／L)：71.74±2.61,68.17±2.51。200ng／ml BMP-2(21天,μg／L)：59.27±3.49,52.8±2.06。结论：BMP-2蛋白可促进退变腰椎间盘细胞分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原,增加细胞活性,恢复椎间盘的功能和活性,因此运用BMP-2椎间盘内注射有望成为椎间盘退变疾病生物治疗的方法之一。第四部分：bFGF对人退变椎间盘髓核细胞影响的实验研究目的：探讨bFGF对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响,观察退变髓核细胞基因表达量高于正常髓核细胞的生长刺激因子对退变髓核细胞的影响。方法：分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变椎间盘髓核细胞分为5组。A组：加入100ng／mlbFGF,B组：加入200ng／mlbFGF,C组：500ng／mlbFGF,D组：1000ng／ml bFGF,E组：对照组,不加干扰因素。通过对试验组和对照组髓核细胞测定细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达。检测细胞外基质Ⅱ型胶原和糖胺多糖表达水平。结果：bFGF刺激退变髓核细胞,Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA,细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在第7天较对照组增加明显。14天、21天Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA明显低于对照组。但细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在14天、21天两个时间点仍高于正常组。结论：根据本研究结果结合文献调研,bFGF在椎间盘髓核细胞中存在着双重效应(促进或改善椎间盘退变),那么如何利用它来治疗临床上的椎间盘退行性变将是一个新的课题,有待于进一步深入研究。