背景与目的心脑血管疾病严重危害着人类的身体健康，动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)作为其中最常见的一种血管病变，已成为基础和临床研究的焦点。AS被认为是一种慢性炎症性疾病，伴有免疫反应的炎症过程贯穿于其发生和发展的始终。而AS内膜增生的形成与血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)的过度增殖并从中膜迁移到内膜密切相关。在参与调节AS的诸多分子中，Toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR4)作为一种与免疫性和炎症性疾病密切相关的模式识别受体，其介导的炎症反应在AS的发生、发展中起重要作用。当血管受到损伤时，位于血管中膜层的VSMC活化，并在TLR4的作用下大量增殖迁移至内膜下，分泌多种炎症因子(如IL-1、IL-6、IFN、MCP-1、TNF-α等)，导致血管炎症反应和动脉内膜增生，最终促进AS的形成。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是调节血管结构和功能状态的重要信号分子，ROS的蓄积可诱导炎症因子的表达，促进AS的发生和发展。目前，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶被认为是血管内生成ROS的主要酶体，是维持血管细胞氧化还原状态的一个重要决定因素。NADPH氧化酶产生的ROS可作为第二信使，激活细胞内的信号转导通路，参与动脉内膜增生和血管炎症反应，进而影响AS的发生和发展。近年来研究发现NADPH氧化酶在TLR4的表达和活化中发挥着重要作用，但NADPH氧化酶是否通过TLR4参与调节VSMC的增殖迁移以及炎症反应，进而促进动脉内膜增生和AS的发生发展目前尚不清楚。有基于此，本研究拟深入探讨TLR4介导的VSMC增殖迁移和炎症表型在AS中的重要作用，以NADPH氧化酶为切入点，分别采用NADPH氧化酶激动剂血小板源性生长因子BB(Platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)和抑制剂夹竹桃麻素(apocynin)使NADPH氧化酶过表达和表达抑制，探讨NADPH氧化酶在TLR4介导的VSMC增殖迁移、炎症反应和动脉内膜增生中的作用，为深入研究AS形成的机制提供新思路，为寻找防治AS的新靶点提供理论依据。材料与方法：在体动物实验部分：采用非显微外科手术方法，建立wire诱导的小鼠颈动脉损伤模型。根据实验动物来源及干预措施的不同，分别分为：C57BL/6J小鼠：①假手术组，②手术组(手术损伤左侧颈总动脉)，③手术+NADPH氧化酶抑制剂组(手术+apocynin灌胃200mg/kg.d)；TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠：①假手术组，②手术组(手术损伤左侧颈总动脉)，③手术+NADPH氧化酶抑制剂组(手术+apocynin灌胃200mg/kg.d)。在小鼠颈动脉损伤后14天，分别取各组小鼠损伤侧颈总动脉，采用HE染色方法在显微镜下观察新生内膜增生情况并计算内膜/中膜的比值；采用Western blot方法检测损伤动脉TLR4蛋白的表达情况。在小鼠颈动脉损伤后14天，分别采集各组小鼠外周血液，采用ELISA方法测定炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平。离体细胞实验部分：采用组织贴块法培养C57和TLR4-/-小鼠胸主动脉VSMCs，倒置相差显微镜下观察C57及TLR4-/-VSMCs生长形态，并通过α-SMA免疫荧光染色鉴定所培养的VSMCs，选取生长良好的3-6代细胞进行实验。根据细胞来源及干预措施的不同分为：C57-VSMCs：①对照组(加入等体积的PBS溶液)；②P DGF-BB处理组(加20ug/L PDGF-BB，37℃5%CO2培养24h)；③Apocynin处理组(加100umol/Lapocynin预处理1h后再加20ug/L PDGF-BB，37℃5%CO2培养24h)。TLR4-/--VSMCs：①对照组(加入等体积的PBS溶液)；②PDGF-BB处理组(加20ug/L PDGF-BB，37℃5%CO2培养24h)；③Apocynin处理组(加100umol/L apocynin预处理1h后再加20ug/LPDGF-BB，37℃5%CO2培养24h)。干预结束后分别收集各干预组细胞，采用DCFH-DA处理细胞并使用流式细胞术检测VSMCs中ROS的产生情况；采用Western blot方法检测VSMCs中TLR4蛋白的表达情况；采用MTT染色法及改良Boyden小室法检测VSMCs的增殖和迁移情况。干预结束后分别收集各干预组细胞上清，采用ELISA方法测定炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平。结果：1. C57小鼠颈动脉损伤后动脉内膜明显增生，内膜/中膜的比值显著增高，且损伤血管局部TLR4蛋白及外周血炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)水平升高。而TLR4-/-可显著抑制颈动脉损伤后动脉内膜增生及外周血炎症因子水平。表明TLR4参与调控颈动脉损伤后动脉内膜增生及炎症反应过程。2.与C57小鼠手术组相比，颈动脉损伤后加用NADPH氧化酶抑制剂apocynin可明显抑制颈动脉内膜增生、损伤血管局部TLR4蛋白表达以及外周血IL-6、IL-1β和TNF-α水平。而TLR4-/-小鼠加用apocynin后颈总动脉内膜增生及炎症因子水平未受到明显抑制。表明NADPH氧化酶参与调节血管损伤后TLR4介导的新生内膜形成及炎症反应过程。3. C57-VSMCs经NADPH氧化酶激动剂PDGF-BB刺激后，VMSCs增殖迁移能力增强、TLR4蛋白及炎症因子表达水平明显增加。而TLR4-/-可显著抑制VSMCs增殖迁移及炎症因子的表达。表明TLR4在VSMC增殖迁移及炎症反应中发挥重要的调节作用。4. C57-VSMCs经NADPH氧化酶激动剂PDGF-BB刺激后，VSMCs内ROS的产生明显增加，而NADPH氧化酶抑制剂apocynin可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCs内ROS生成。且TLR4-/--VSMCs各组间ROS的变化趋势与C57-VSMCs一致。结合PDGF-BB在促进TLR4蛋白表达中的作用，提示NADPH氧化酶衍生的ROS参与调节TLR4蛋白的表达。5.采用NADPH氧化酶抑制剂apocynin下调NADPH氧化酶活性，抑制ROS产生，可明显抑制C57-VSMCs增殖迁移以及TLR4蛋白和炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)表达。而TLR4-/--VSMCs加用apocynin后增殖迁移及炎症因子水平未受到明显抑制。表明NADPH氧化酶衍生的ROS参与调节TLR4介导的VSMC增殖迁移和炎症表型。结论：NADPH氧化酶衍生的ROS参与调节TLR4介导的VSMC增殖和炎症表型，从而在AS的内膜增生和炎症反应过程中起到重要作用。针对这一环节的有效干预可能为AS的防治提供新的策略，并为AS发病机制的研究提供了一定的理论依据。