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聚γ-谷氨酸(polyγ-glutamicacid;γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料。地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02是γ-PGA的产生菌,其发酵液由于较粘稠而导致溶氧很差,溶氧成为γ-PGA产量提高的限制性因素之一。透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种来源于原核生物的氧结合蛋白。本研究旨在B.licheniformisWX-02中表达透明颤菌血红蛋白基因(vgb)来改善其发酵过程中氧的利用效率,进而改善菌体生长,提高产量。
本研究构建了能整合于芽胞杆菌染色体上的表达载体pDG1730-vgb,其含有芽胞杆菌α-淀粉酶基因的整合位点,通过Spizizen感受态转化导入B.licheniformisWX-02中,PCR验证表明vgb成功整合到其染色体上;经CO差光光谱分析,重组菌株B.licheniformisM2有VHb表达活性;摇瓶发酵实验结果显示,摇床转速为180r/min,发酵36h的条件下,250mL三角瓶中发酵液装液量为50mL时,M2的生物量和γ-PGA产量分别为4.5g/L和27.71g/L,高于出发菌株WX-026.43%和6.74%;装液量为100mL时,M2发酵的生物量和γ-PGA产量分别为4.17g/L和26.59g/L,高于出发菌株WX-0215.02%和21.7%。vgb的表达促进了菌体和γ-PGA产量的增长,产物比生物量的增长明显,促进效果随着供氧条件的降低而增加。3L发酵罐分批发酵结果显示,搅拌转速为600r/min,通气量为2L/min时,M2的生物量(OD600)达到7.39,比出发菌株WX-02提高了25.5%,γ-PGA产量达到33.5g/L,比WX-02提高了20%,进一步证实VHb蛋白的表达对γ-PGA产量和菌体生长的促进作用。
整合载体pDG1730-vgb在高产γ-PGA的枯草芽胞杆菌W003中的整合表达已有初步结果,本研究还构建了另一个整合载体psacB-vgb,含有枯草芽胞杆菌果聚糖酶基因(sacB)的整合位点,其在高产γ-PGA的枯草芽胞杆菌W003中的整合表达有待进一步研究。