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F1Fo ATP合酶是能量代谢的关键酶,它利用跨膜的质子动力势合成生物体内的能量通货—ATP。叶绿体ATP合酶是由突出于膜外的CF1和嵌于膜内的CF0两部分组成的。CFo形成跨膜的质子通道,并为CF1提供膜上的结合位点。CF1上具有核苷酸结合和催化位点。体外培养的光自养细胞也是研究光合机构形成的一种新材料,其最重要的优点是其生理条件和生长速率的调节及其组织分化容易控制。本文实验工作主要集中在叶绿体ATP合酶(亚基的结构与功能研究、光自养型愈伤组织的诱导培养及其自养过程中光合特性和光合磷酸化活力的变化等方面。叶绿体ATP合酶(亚基定点突变对其功能的影响 利用突变引物和PCR方法将菠菜叶绿体ATP合酶(亚基N端第三位的亮氨酸(Leu)分别突变为异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)和脯氨酸(Pro)。(亚基及其突变体基因均能在 E.coli中正常表达。检测突变对(亚基功能和ATP合酶合成ATP活力的影响。结果显示(亚基突变体抑制游离CF1或膜结合ATP合酶的Ca2+-ATP水解能力和其堵塞跨膜质子泄漏功能均比野生型的低。Leu突变成Phe或Ile后,突变体蛋白恢复缺失(亚基类囊体膜ATP合成活力的能力比野生型的稍高些,但其它突变体的均比野生型的低。这些结果表明,叶绿体ATP合酶(亚基N端第三位氨基酸的疏水、非极性和不带电荷性质对(亚基的抑制ATP水解和堵塞跨膜质子泄漏功能是非常重要的。 2. 叶绿体ATP合酶(亚基缺失突变对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度及其ATP合成能力的影响外加(亚基或缺失突变的(亚基蛋白于叶绿体悬浮液中对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度和光合磷酸化活力均有促进作用。N端缺失突变的(亚基随着其缺失氨基酸残基数目的增加, 它们对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度和光合磷酸化活力的促进作用逐渐减弱, 且它们与缺失(亚基的类囊体膜重组后的ATP合成活力也逐渐减小; 但是C端缺失突变的(亚基随着其缺失氨基酸残基数目的增加, 它们的促进作用反而逐渐增强, 且与缺失(亚<WP=6>基类囊体膜重组后的ATP合成活力也逐渐增大, 但均仍不如野生型(亚基的高。这些结果表明, 叶绿体ATP合酶(亚基的N端结构可通过调节(亚基的堵塞跨膜质子泄漏能力影响合酶的ATP合成能力, 叶绿体ATP合酶(亚基的C端区域对于ATP的合成具有微妙的调节作用。3. 烟草光自养型愈伤组织的培养及其自养过程中光合磷酸化活力的变化本文首次通过将烟草愈伤组织从蔗糖浓度为20 g/L的固体培养基转移到蔗糖浓度逐渐降低的液体培养基(培养液)中依次培养的方法,将它们从异养逐步诱导转变为光自养型的愈伤组织。当愈伤组织在蔗糖浓度为20 g/L的培养液中培养4周后,其叶绿素含量、可溶性蛋白含量、叶绿体的ATP水解(ATPase)活力和非循环光合磷酸化活力均很低。愈伤组织再转移到蔗糖浓度为10 g/L的培养液中培养2周后,其叶绿素含量显著上升,同时其可溶性蛋白含量和叶绿体的ATPase活力明显增大,但是其叶绿体的光合磷酸化活力只是稍有所上升。将愈伤组织再于蔗糖浓度为5 g/L的培养液中培养1周后,其叶绿体的光合磷酸化活力显著增大,且其叶绿素含量、可溶性蛋白含量、叶绿体的ATPase活力有所增加。愈伤组织最后转接到无蔗糖的培养液中培养1周后,其叶绿体的ATPase活力、光合磷酸化活力等仍上升,且此时愈伤组织的净光合速率才从负值增大为正值。这些结果表明愈伤组织从异养转变为光自养过程中,其叶绿体的光合磷酸化功能是逐渐完善的。愈伤组织先快速合成叶绿素,然后其ATP合酶的活性增加和膜的垛叠程度上升,最后其叶绿体的光合磷酸化功能趋向完善,此时愈伤组织才转变为光自养型的愈伤组织。4. 胡萝卜光自养型愈伤组织的诱导培养及其光合特性首次经诱导得到胡萝卜光自养型愈伤组织。以叶绿素为单位计算,获得的光自养型愈伤组织的光合活力达到甚至超过了整体植株叶片水平。同时测定愈伤组织转变为光自养过程中光合特性的变化,结果表明其叶绿素含量逐渐上升、暗呼吸速率和Chl a/Chl b比值逐渐下降;而且用电子显微镜观察到愈伤组织中叶绿体结构逐渐发育的过程。