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研究背景:心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)是当前世界上发病率与致死率最高的冠状动脉疾病。心肌梗死发生后的心脏保护及预后处理依然是当前临床上一个重要的研究课题。目前对于心肌梗死的治疗,临床上更多关注的是心肌细胞的凋亡及梗死面积大小。而治疗中缺血再灌注后引起的微血管损伤会影响梗死面积并促进炎症,对于梗死后心肌重构极为不利。因此,减少心肌梗死后的急性炎症反应或将成为降低心肌梗死面积及改善患者预后的一个有效方法。心肌梗死后的炎症反应包括了初始的促炎反应及后续的抗炎反应,持续且剧烈的促炎反应以及促炎抗炎动态平衡不利于梗死后的心肌重塑过程,且会加大心脏衰竭风险。因此研究在机械性防御的固有免疫与具备治疗功能的适应性免疫中发挥作用的细胞群体可能成为改善心梗后不良重塑的重要切入点。树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)是连接固有免疫与适应性免疫的重要抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells,APC),目前已有研究表明,DCs在急性心梗发生后会大量向缺血区域迁移聚集,且心脏特异性的耐受型DCs参与了梗死后的心肌重塑过程,并可降低梗死面积。因此,研究心肌梗死后DCs的作用和功能将有望为调节心肌重塑、改善不良预后提供新的治疗策略。已有研究表明,叉头盒转录因子(Fork head box transcription factor,FOX)家族成员FOXO1对DCs功能具有调控作用。受细菌刺激活化后,FOXO1能够促进DCs吞噬和迁移,并向淋巴结聚集以激活下游初始T细胞;而缺失FOXO1则会抑制在细菌感染下的免疫反应。此外,FOXO1可调控DCs产生炎性细胞因子的能力,过表达FOXO1引起白介素细胞因子12(Interleukin 12,IL-12),肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor-alpha,TNF-α)等炎性细胞因子表达升高。细胞周期依赖蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase,CDK5)最早是在神经元细胞中发现的,它能调控神经元的迁移,神经树突的引导以及发育等功能。现已证明其在其他非神经系统疾病中具有重要调控作用例如肿瘤免疫,类风湿性关节炎等。现已发现CDK5下游多个作用靶点,其中CDK5可磷酸化FOXO1并抑制其转录活动。然而,目前CDK5在DCs中的调控功能还尚未被明确。综上,我们推测,CDK5可对FOXO1转录活动进行调控,通过磷酸化FOXO1抑制其转录活性,进而影响心肌梗死中的DCs相关功能,包括DCs的成熟,吞噬迁移,细胞因子分泌等。本课题拟通过氧糖剥夺条件下,探讨CDK5与FOXO1在小鼠梗死心脏裂解物诱导DC2.4细胞相关功能调控中的作用,探索心肌梗死后DCs受到调控的机制,为DCs作为改善心肌梗死不良预后及减少梗死面积的重要靶点提供新的思路。实验目的:本实验以小鼠DC2.4细胞作为研究对象,采用体外氧糖剥夺模型,给予小鼠梗死心脏裂解上清液模拟心肌梗死后DCs所处微环境,同时给予CDK5抑制剂Roscovitine及CDK5 si RNA,观察DC2.4细胞的成熟情况,检测吞噬迁移能力变化,细胞上清液细胞因子表达水平,探讨CDK5与FOXO1在心肌梗死后的微环境中对DC2.4细胞功能的调控及其机制,为DCs在缺血疾病中的应用提供新的理论依据。实验方法:以小鼠DC2.4细胞系作为研究对象。分组包括:常氧组与氧糖剥夺组(OGD组),每个组下设置对照组(Control组),Roscovitine给药组,梗死心脏裂解上清液组,Roscovitine+梗死心脏裂解上清液组。MTT法检测Roscovitine处理下DC2.4细胞的增殖能力;流式细胞术检测各组中DC2.4细胞的成熟情况(CD80、CD86、MHC II)及吞噬能力;Transwell小室迁移实验检测各组DC2.4细胞迁移能力;RNA-seq技术检测DC2.4细胞差异基因;RTq PCR验证差异基因m RNA的表达水平;Western blot法检测各组CDK5、FOXO1及phospho-FOXO1(Ser249)表达情况;免疫荧光法检测FOXO1在各组DC2.4细胞中的分布情况;ELISA试剂盒检测不同组DC2.4细胞上清液中IL-1β、IFN-γ、IL-10的表达情况。实验结果:1)Roscovitine对DC2.4细胞增殖能力的影响:MTT结果显示,Roscovitine在72h的IC50为19.49μM,在浓度大于30μM时,细胞活力发生显著下降。因此,我们选择对细胞活力无明显抑制的10μM作为Roscovitine给药浓度。2)小鼠梗死心脏裂解上清液对DC2.4细胞形态的影响:与Control组相比,在给予50μg?ml-1梗死心脏裂解上清液后,DC2.4单个细胞的面积显著增加,且细胞生出伪足,分支增多,不再呈葡萄串样生长,呈现出成熟DCs的特征。3)Roscovitine对梗死心脏裂解上清液诱导的DC2.4细胞成熟作用的影响:与常氧组相比,OGD组的DC2.4细胞CD80和MHC II的表达均有所上调。而给予Roscovitine的各组CD80、CD86及MHC II的表达均有所降低(P<0.01),在加入梗死心脏裂解上清液的组中,CD80、CD86及MHC II的表达又有显著上调(P<0.001)。4)Roscovitine对梗死心脏裂解上清液诱导的DC2.4细胞吞噬功能的影响:相比于常氧组,OGD组的DC2.4细胞吞噬百分率下降,而在加入梗死心脏裂解上清液后百分率进一步下降,表明细胞吞噬能力的减弱。加入Roscovitine后,DC2.4细胞吞噬百分率显著上调(P<0.05,P<0.01)表明吞噬能力增强。5)Roscovitine对梗死心脏裂解上清液诱导的DC2.4细胞迁移能力的影响:OGD组的DC2.4细胞相比较于常氧组的细胞,其迁移能力显著增强(P<0.01),而加入梗死心脏裂解上清液的细胞迁移能力也显著增强。与加入梗死心脏裂解上清液组相比,在给予Roscovitine后,进入下室的细胞数量减少,表明Roscovitine能够抑制DC2.4细胞的迁移。6)Roscovitine对梗死心脏裂解上清液诱导的DC2.4细胞因子表达的影响:OGD组与常氧组相比,细胞上清液IL-10的表达略有下调,而IFN-γ的表达略有增多,但IL-1β变化不明显。而加入Roscovitine后,OGD组的细胞较对照组细胞上清液IL-10表达升高,常氧组细胞较对照组IL-10表达则下调(P<0.05)。加入梗死心脏裂解上清液的组别相较其对照组,IL-1β和IFN-γ的表达显著增加(P<0.01),而Roscovitine可抑制这一增加作用。7)RNA-seq筛选差异基因及m RNA验证结果:加入心脏裂解液蛋白与Roscovitine的组别与对照组相比,在核糖体蛋白、氧化磷酸化、溶酶体相关进程、Toll样受体通路、FOXO信号通路、NK细胞介导的细胞毒性等相关基因表达中有显著性差异,因此我们筛选了几个具有显著差异的基因,具体包括CCL3、CCL4、CCL7、Vegfa、TNF、FOXO1、Cox6a2共7个基因进行m RNA转录水平的验证。结果表明,与常氧组相比,OGD组的Vegf、CCL3、CCL4、CCL7、TNF、Cox6a2、FOXO1等m RNA转录水平均显著增强(P<0.01),其中,加入Roscovitine后,CCL3、CCL4、TNF、Cox6a2、FOXO1 m RNA转录水平显著下调(P<0.01)。加入梗死心脏裂解上清液后,各组与对照组相比,各基因表达水平都显著下降,而在加入Roscovitine后可抑制这一变化。8)Roscovitine对梗死心脏裂解上清液诱导的DC2.4细胞中FOXO1胞内及表达的影响:加入Roscovitine后,细胞中FOXO1表达略有下降,而加入梗死心脏裂解上清液的组别FOXO1表达水平则无显著变化。给予Roscovitine后,我们可以观察到p-FOXO1与CDK5表达水平显著下降(P<0.05,P<0.01),而给予了梗死心脏裂解上清液的组别,pFOXO和CDK5的表达水平有所增加,其中常氧组变化更为明显。而在免疫荧光结果中,与Control组相比,给予Roscovitine后检测到FOXO1在核内信号加强而在胞内信号减弱。各组CDK5表达情况则无明显变化。9)干扰CDK5对DC2.4细胞中FOXO1表达的影响:与转染了nt si RNA的DC2.4相比,转染了CDK5 si RNA的DC2.4细胞的Ser249位的FOXO1磷酸化水平与CDK5表达水平显著降低(P<0.01)。免疫荧光结果中发现FOXO1在CDK5被干扰的情况下入核增加胞内信号减弱,以上结果与加入Roscovitine后的蛋白变化趋势一致,这表明,DC2.4细胞中,Ser249位的FOXO1的磷酸化平受到CDK5的调控。10)干扰CDK5对DC2.4细胞迁移能力的影响:加入梗死心脏裂解上清液的各组相较于其对照组,进入下室的细胞数量有显著的增加,而CDK5 si RNA干扰组中下室细胞数量相较于给予梗死心脏裂解上清液刺激的nt si RNA中细胞数量有显著下降。以上结果与加入Roscovitine的细胞相比表现出一致的趋势。11)干扰CDK5对DC2.4细胞吞噬能力的影响:CDK5 si RNA组的DC2.4细胞吞噬能力强于对照组,而在加入梗死心脏裂解上清液的各组中,吞噬能力要显著减弱,同时干扰了CDK5的细胞能够抑制吞噬能力减弱这一结果。这一结果与前面使用Roscovitine的细胞吞噬能力的变化趋势一致,证明CDK5调控了DC2.4细胞的吞噬功能。12)干扰CDK5对DC2.4细胞成熟的影响:干扰了CDK5的DC2.4细胞相比于对照组CD80、CD86及MHC II表达变弱(P<0.01),而加入梗死心脏裂解上清液的各组与对照组相比,CD80、CD86及MHC II的表达显著升高(P<0.01)。此外,与常氧组相比,OGD组的DC2.4细胞表现出更强的CD80表达。各组的结果变化趋势都与加入Roscovitine的结果表现一致,说明CDK5对DC2.4细胞的成熟情况有影响。实验结论:(1)梗死心脏裂解上清液可增强DC2.4细胞迁移能力,升高细胞因子IL-1β、IFN-γ水平,进而促进其成熟。(2)OGD条件下,Roscovitine可降低梗死心脏裂解上清液诱导的DC2.4细胞迁移能力,增强其吞噬能力。(3)OGD条件下,Roscovitine可增加梗死心脏裂解上清液诱导的DC2.4细胞上清IL-1β水平,降低IL-10与IFN-γ水平。(4)Roscovitine能通过抑制CDK5介导FOXO1(S249)磷酸化,从而调控DC2.4细胞的功能。