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背景：已知肿瘤细胞转移潜能与促进肿瘤细胞生长、存活、血管生成、侵袭和转移的体内平衡因素的相互作用有关。肝细胞癌(HCC)是第三大最常见的癌症,全世界每年有约60万病人死于这种疾病,高发地理区域包括亚洲东部、中部非洲和西部非洲的一些国家。肝癌是一种高度血管化的肿瘤,这使得血管靶向治疗很适用于HCC的治疗。HCC是表型和遗传异质性的多克隆疾病,并对传统化疗抵抗。淋巴道转移是一个发展的过程,涉及多种基因,死亡率高、预后差的淋巴道转移的不确定机制,是肿瘤学领域中的突出问题。因此,了解肿瘤转移的确切机制,此过程中的肿瘤标志物、以及宿主细胞的特异表达定位等都非常重要。Hca-F与Hca-P是一对同源小鼠腹水肝癌细胞系,具有特异向淋巴道转移的潜能。当接种于615小鼠皮下时Hca-F拥有高淋巴道转移潜能(>70%),Hca-P拥有低淋巴道转移潜能(<30%).Hca-F和Hca-P只转移到淋巴结而不到其他器官,是研究肝癌淋巴道转移的理想模型。蛋白质的亚细胞特异表达定位可提供不同蛋白质的功能特性,研究特殊的亚细胞成分和细胞大分子结构。蛋白质组学分析可提高检测低拷贝数蛋白质的概率,并分离细胞器混合蛋白或其他多蛋白复合物,已逐渐成为亚细胞蛋白质组学的重点。亚细胞蛋白质组研究不仅可以提供蛋白亚细胞定位和某些蛋白质的功能信息而且还有助于了解特殊亚细胞成分(或其他细胞器多蛋白复合物)的结构和生物学功能,差异鉴定蛋白质肯能涉及核酸结合、氧化还原酶和细胞骨架蛋白完整性、信号转导通路、细胞结构和运动、核苷酸和核酸代谢、肌动蛋白细胞骨架、粘着调控、抗原处理和呈递等。我们分析和比较了一些转移相关的生物标志物的表达水平、亚细胞表达部位、比较了不同转移潜能细胞株的转移相关标记物。这些研究结果显示高淋巴转移潜能细胞株相关生物标记物表达高于低淋巴转移潜能细胞株,通过分离细胞成分确定这些转移相关生物标记物与小鼠淋巴道转移有关。目标：1.在完整细胞中分离亚细胞成分2.观察淋巴道转移生物标记物凝溶胶蛋白,JNK和Annexin7的表达水平3.比较不同转移潜能细胞株和上调或下调后的生物标记物表达水平4.发现在肝癌腹水细胞中表达水平变化中生物标记物与肿瘤淋巴道转移间的相关性方法：1、Hca-F和Hca-P肿瘤细胞注入近交系615小鼠腹腔分两步在适宜生长条件下将细胞注入到接种瓶中,37℃,5%CO2二十四小时培养收获大量细胞,台盼蓝试验测定细胞活力。2、Hca-F和Hca-P细胞(2×106细胞/只)接种到近交系615小鼠左足垫,每20只为一组接种后28天处死老鼠收集淋巴结,HE染色显微镜下检查,计算淋巴结转移率3、清洗细胞冷冻离心剂离心,细胞沉淀转移到其他反应管,缓冲液洗涤三次,4℃冷冻离心剂离心。使用亚细胞蛋白质组分分离提取试剂盒,提取过程提供4个蛋白组分以降低蛋白复杂性。为便于分离,细胞悬液分装为每反应管含3-5×106细胞。四个组分分离后可获得细胞质、细胞膜和膜结构细胞器、细胞核和细胞骨架蛋白等四个组分。4、蛋白浓度测定。使用Bradford分析以牛血清白蛋白(BSA)为标准对三个淋巴道转移三个相关生物标记物凝溶胶蛋白,JNK和Annexin7的表达水平,进行免疫印迹分析。5、免疫印迹分析评估每个组分蛋白的水平提取蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚偏氟乙烯膜给予相应蛋白质抗体,充分洗涤后电化学发光免疫印迹发检测条带,根据不同的亚细胞表达部位使用不同的对照蛋白6、使用SPSS软件对淋巴道转移相关蛋白进行统计以对比高低淋巴道转移肿瘤细胞系的差异7、进一步分析比较上调或下调Annexin7的蛋白表达,为建立转染shRNA(短发夹RNA)的小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P设计和插入了3条shRNA以沉默Annexin7基于RT-PCR和免疫印迹,并经400μg/μLG418筛选,PCR扩增稳定转染P cDNA3.1和shRNA- Annexin7的Hca-F和Hca-P细胞。用bamH1和EcoRl消化Annexin7和P cDNA3.1质粒结果：1、接种7天后Hca-F荷瘤小鼠和Hca-P的荷瘤小鼠可见明显移植瘤,两组肿瘤形成率均为100%。分别成功建立了转染上调和下调Annexin7表达的shRNA Hca-F细胞和P cDNA3.1Hca-P细胞。2、使用蛋白质提取试剂盒(S-PEK)分离了四个亚细胞组分。提取缓冲液1分离了细胞浆蛋白质(组分1),提取缓冲液2分离了细胞膜和细胞器膜(组分2),提取缓冲液3分离了细胞核蛋白(组分3),提取缓冲液4分离了细胞骨架蛋白。3、利用免疫印迹分析测定了凝溶胶蛋白的相对表达水平。通过对每个组分的平均值计算六个值三次均数,数据统计分析凝溶胶蛋白的标准差和评价值为：在组分1,F-细胞0.84±0.05,P-细胞0.77±0.05,F-细胞与P-细胞相比表达略高。在组分2,P-细胞未发现有凝溶胶蛋白的表达,两种细胞中组分4在F-细胞中是0.69±0.061,p-细胞为0.36±0.049,组分1、组分2、组分4等三个组分分别为：0.80±0.063,0.19±0.047,和0.53±0.018所有数据统计学分析均<0.05。4、利用免疫印迹分析测定了Hca-F和Hca-P细胞的JNK表达水平。这两种细胞的JNK表达于细胞核(组分3)和细胞骨架(组分4),组分3表达高于组分4.统计表明组分3在F细胞为0.31±0.051,P细胞0.22±0.027,组分4在F细胞为0.86±0.073,P细胞为0.74±0.069。5、利用免疫印迹分析测定了Hca-F和Hca-P细胞的Annexin7表达水平,测得Annexin7在细胞浆(组分1)细胞膜(组分2)和细胞骨架(组分4)存在,Hca-F细胞的表达水平明显比其他细胞系要高,Hca-P的表达则在所有四种细胞系中最低。在Hca-P、Hca-P、shRNA-Hca-F、P cDNA3.1-Hca-F细胞中,组分1分别为0.099±0.015,0.02±0.005,0.04±0.009和0.028±0.006(51KDa Annexin7亚型)和0.73±0.064、0.48±0.035、0.62±0.055和0.59±0.049(47KDa Annexin7亚型)；组分2分别为0.36±0.049、0.22±0.018、0.28±0.033和0.25±0.024；组分4分别0.53±0.055、0.39±0.022、0.48±0.042和0.43±0.037。在不同组分的均值资料分析中,组分1为0.60±0.015,组分2为0.28±0.080,组分4为0.45±0.096,51KDa Annexin7亚型和47KDa Annexin7亚型两个条带的表达分别为0.061±0.005和0.76±0.069表明Annexin7蛋白质亚型表达可能与其亚细胞定位相关。结论：1、本研究结果表明,Annexin7、凝溶胶蛋白、JNK在高淋巴道转移肿瘤细胞中高水平表达,可能与肿瘤淋巴道转移发生发展相关联。2、不同的蛋白质亚细胞定位表达变化可能在肿瘤转移发生的过程中具有不同的作用。3、由于功能表达的差异,51KDa Annexin7亚型和47KDa Annexin7两种蛋白亚型只在肿瘤细胞质中而不在其他部位表达。4、Annexin7表达上调或下调后可调节其他淋巴道转移相关蛋白凝溶胶蛋白、JNK的表达。5、特异性蛋白亚细胞组分的分离、鉴定将有利于提供转移风险的预测以及抗肿瘤药物的筛选。