桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响及其分子机制研究

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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要人兽共患致病菌,它的一个重要特性就是在感染部位形成生物膜,生物膜形成后可通过多种途径引发多种感染病,对畜牧业造成了严重影响。生物膜的形成是一个复杂的过程,而胞外DNA(eDNA)是生物膜初始黏附阶段的必需成分之一,细胞间多糖黏附素(PIA)在生物膜的聚集阶段形成过程中发挥着重要作用。本论文旨在通过研究桃陀酚对金黄色葡萄球菌临床株和标准株的抑制作用,并探讨其对PIA合成和eDNA分泌的影响,为金黄色葡萄球菌临床感染提供新的方法,并为进一步研究桃柁酚的作用机制奠定基础。1.桃柁酚对金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜的药物敏感性测定:用微量肉汤稀释法测定桃柁酚对10株金黄色葡萄球菌浮游菌的最小抑菌浓度(MICs)和最小杀菌浓度(MBCs),用平板擦拭法测定桃柁酚对10株金黄色葡萄球菌生物膜最小抑菌浓度(MBICs)和最小杀菌浓度(MBBCs),并用结晶紫半定量法进一步验证。结果表明,桃柁酚能有效抑制金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜,桃柁酚对10株金黄色葡萄球菌悬浮菌的MICs值范围为1~2μg/mL,MBCs值范围为2~4μg/mL;对10株金黄色葡萄球菌生物膜的MICs值范围为4~16μg/mL,MBCs范围为32~128μg/mL。结晶紫半定量试验表明,桃柁酚达到抑菌浓度后,生物膜可被有效抑制;而在亚抑菌浓度(1/8MIC)时,桃陀酚可诱导生物膜的形成。2.桃陀酚对PIA合成和eDNA释放的影响:采用斑点印迹法检测桃陀酚对PIA在生物膜形成过程中合成的作用,提取eDNA检测桃柁酚对eDNA释放的影响。结果显示,桃柁酚可抑制PIA的合成,有效减少eDNA的释放,且抑制趋势呈剂量依赖关系。值得注意的是,在1/8MIC药物浓度时,桃柁酚可诱导eDNA的释放。3.桃柁酚对生物膜合成相关基因的影响:利用实时荧光定量RT-PCR分析桃柁酚对PIA的主要合成基因icaA和影响eDNA分泌的主要基因cidA及其调控基因agrA,sarA的作用,结果表明,cidA和sarA基因的表达随药物浓度的升高先被诱导后被抑制,icaA和agrA基因的表达随药物浓度的升高均可被抑制,其中agrA的抑制呈浓度依赖性。说明桃柁酚可通过影响agr和sar调控系统,影响icaA和cidA基因的转录。4.激光共聚焦显微镜观察:通过激光共聚焦显微镜观察不同桃柁酚浓度在不同时间段对金黄色葡萄球菌生物膜的作用,结果发现,6h后,1/8MIC浓度的桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜有明显的诱导作用,当药物浓度达到MIC浓度时,可抑制生物膜形成;在生物膜形成后加药,随着药物浓度增加,生物膜逐渐被清除且生物膜内的细菌被杀死。
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