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异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循环中的关键酶。它以NAD(P)+为辅酶，同时以Mg2+或Mn2+为激活剂，催化底物异柠檬酸(isocitrate, ICT)氧化脱羧，生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)和NAD(P)H，并生成CO2。根据依赖的辅酶不同，IDH可分为NAD+-依赖型IDH(NAD-IDH，EC 1.1.1.41)和NADP+-依赖型IDH(NADP-IDH，EC 1.1.1.42)，其中NAD-IDH更为古老。根据系统聚类分析，IDH可以分为TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ三个亚家族。根据聚合形式不同，IDH又可分为单体、同源二聚体、同源四聚体和多聚体酶。目前研究最多的是同源二聚体NADP-IDH，而对四聚体IDH的研究鲜见报道。
1.粪味梭菌异柠檬酸脱氢酶的酶学性质鉴定
首先通过分子生物学技术异源表达了粪味梭菌(Clostridium scatologenes)的IDH(简称CsIDH)，再对纯化的CsIDH进行了详细的酶学性质鉴定。凝胶过滤层析实验结果显示CsIDH的全酶分子量为158.1kDa，结合SDS-PAGE分析其亚基分子量约为36.1kDa的结果，推断CsIDH为同源四聚体酶。酶学性质的鉴定结果显示，Mn2+是CsIDH催化反应的最强激活剂，其次是Mg2+，而Zn2+是CsIDH催化活性的最强抑制剂。酶动力学检测结果显示，在Mn2+或Mg2+存在时，CsIDH对辅酶NADP+均未表现出明显的活性，但CsIDH对辅酶NAD+的催化效率(kcat/Km)分别是0.313±0.0326μM-1s-1和0.243±0.0284μM-1s-1，对底物异柠檬酸(ICT)的催化效率分别是1.48±0.32μM-1s-1和1.07±0.36μM-1s-1。在Mn2+条件下，CsIDH的最适反应pH为7.5，最适温度为50℃；在Mg2+条件下，最适pH为8.0，最适温度则是55℃。热稳定性检测结果显示，当Mn2+和Mg2+作为反应激活剂时，CsIDH在40℃时仍具有90%以上的催化活性，但当温度为55℃时，CsIDH丧失了全部活性。
2.粪味梭菌异柠檬酸脱氢酶的辅酶特异性改造
IDH进化机制研究证明NAD-IDH比NADP-IDH更为古老，而且为了适应碳源贫瘠的生存环境，其辅酶特异性发生了从NAD+向NADP+的转变。为了证明CsIDH也具有演化为NADP+-依赖型酶的潜力，我们将CsIDH中与NAD+结合的关键氨基酸替换成NADP+-依赖型IDH中与NADP+结合的关键残基，构建了两点突变体酶D265K/I266Y和三点突变体酶D265K/I266Y/S272V。实验结果显示，突变体酶对辅酶NADP+均表现出一定的催化活性。突变体酶D265K/I266Y和D265K/I266Y/S272V对辅酶NADP+的偏好性分别是其对NAD+的14.8倍和21.26倍。说明突变体酶均成功实现了辅酶特异性的转换。同时这从一个侧面说明了IDH聚合状态的分化可能早于其辅酶依赖性的功能演化。
3.粪味梭菌异柠檬酸脱氢酶聚合形式的进化意义
系统进化树显示，高异柠檬酸脱氢酶(homoisocitrate dehydrogenase, HIDH)家族为β-脱羧脱氢酶超家族的祖先酶。鉴于本研究中的CsIDH与嗜热栖热菌(Thermusthermophiles)HIDH(TtHIDH)均为同源四聚体，氨基酸序列一致性达48%，因此认为也能像TtHIDH的V135M突变体酶一样，CsIDH的四聚体结构可以被改造为二聚体。通过设计，本研究构建了CsIDH突变体酶I135M(M1)，但是M1未能实现聚合形式的改变。于是根据TtHIDH的晶体结构，构建了四点突变体酶V131Y/E133L/I135M/I141V(M4)。结果显示M4确实已解聚为同源二聚体。与野生型CsIDH相比，M4热稳定性明显降低，其对底物的亲和力和催化效率下降了2.28倍和2.64倍。因此四聚体结构对于CsIDH催化效率及热稳定性的维持都至关重要。M4为四聚体NAD-IDH是由四聚体HIDH演化而来的进化机制提供了有力证据。可能NAD+依赖的HIDH祖先蛋白，在进化过程中先形成NAD-IDH祖先形式，即原核同源二聚体和同源四聚体NAD-IDHs。再历经贫瘠碳源的选择，NAD-IDH祖先蛋白发生了辅酶依赖性的转变，演化出NADP-IDH。
在本研究中，以CsIDH为代表的Ⅰ型原核生物同源四聚体NAD-IDH与真核生物线粒体的异源寡聚体NAD-IDH聚在同一进化支，为线粒体内共生起源学说提供了有力支持。鉴于真核生物线粒体NAD-IDH保持了细菌祖先NAD-IDH的结构特征，因此推测可能包含祖先NAD-IDH(如原核生物四聚体NAD-IDH)的早期细菌被原始真核生物吞噬后，在进化过程中，原核生物四聚体NAD-IDH的编码基因发生了倍增事件。随着时间和环境的变化，两部分同源四聚体NAD-IDH的序列和功能发生了趋异进化，分别演化为真核生物线粒体NAD-IDH的催化亚基和调节亚基。该推测还需更多证据的进一步证明。
1.粪味梭菌异柠檬酸脱氢酶的酶学性质鉴定
首先通过分子生物学技术异源表达了粪味梭菌(Clostridium scatologenes)的IDH(简称CsIDH)，再对纯化的CsIDH进行了详细的酶学性质鉴定。凝胶过滤层析实验结果显示CsIDH的全酶分子量为158.1kDa，结合SDS-PAGE分析其亚基分子量约为36.1kDa的结果，推断CsIDH为同源四聚体酶。酶学性质的鉴定结果显示，Mn2+是CsIDH催化反应的最强激活剂，其次是Mg2+，而Zn2+是CsIDH催化活性的最强抑制剂。酶动力学检测结果显示，在Mn2+或Mg2+存在时，CsIDH对辅酶NADP+均未表现出明显的活性，但CsIDH对辅酶NAD+的催化效率(kcat/Km)分别是0.313±0.0326μM-1s-1和0.243±0.0284μM-1s-1，对底物异柠檬酸(ICT)的催化效率分别是1.48±0.32μM-1s-1和1.07±0.36μM-1s-1。在Mn2+条件下，CsIDH的最适反应pH为7.5，最适温度为50℃；在Mg2+条件下，最适pH为8.0，最适温度则是55℃。热稳定性检测结果显示，当Mn2+和Mg2+作为反应激活剂时，CsIDH在40℃时仍具有90%以上的催化活性，但当温度为55℃时，CsIDH丧失了全部活性。
2.粪味梭菌异柠檬酸脱氢酶的辅酶特异性改造
IDH进化机制研究证明NAD-IDH比NADP-IDH更为古老，而且为了适应碳源贫瘠的生存环境，其辅酶特异性发生了从NAD+向NADP+的转变。为了证明CsIDH也具有演化为NADP+-依赖型酶的潜力，我们将CsIDH中与NAD+结合的关键氨基酸替换成NADP+-依赖型IDH中与NADP+结合的关键残基，构建了两点突变体酶D265K/I266Y和三点突变体酶D265K/I266Y/S272V。实验结果显示，突变体酶对辅酶NADP+均表现出一定的催化活性。突变体酶D265K/I266Y和D265K/I266Y/S272V对辅酶NADP+的偏好性分别是其对NAD+的14.8倍和21.26倍。说明突变体酶均成功实现了辅酶特异性的转换。同时这从一个侧面说明了IDH聚合状态的分化可能早于其辅酶依赖性的功能演化。
3.粪味梭菌异柠檬酸脱氢酶聚合形式的进化意义
系统进化树显示，高异柠檬酸脱氢酶(homoisocitrate dehydrogenase, HIDH)家族为β-脱羧脱氢酶超家族的祖先酶。鉴于本研究中的CsIDH与嗜热栖热菌(Thermusthermophiles)HIDH(TtHIDH)均为同源四聚体，氨基酸序列一致性达48%，因此认为也能像TtHIDH的V135M突变体酶一样，CsIDH的四聚体结构可以被改造为二聚体。通过设计，本研究构建了CsIDH突变体酶I135M(M1)，但是M1未能实现聚合形式的改变。于是根据TtHIDH的晶体结构，构建了四点突变体酶V131Y/E133L/I135M/I141V(M4)。结果显示M4确实已解聚为同源二聚体。与野生型CsIDH相比，M4热稳定性明显降低，其对底物的亲和力和催化效率下降了2.28倍和2.64倍。因此四聚体结构对于CsIDH催化效率及热稳定性的维持都至关重要。M4为四聚体NAD-IDH是由四聚体HIDH演化而来的进化机制提供了有力证据。可能NAD+依赖的HIDH祖先蛋白，在进化过程中先形成NAD-IDH祖先形式，即原核同源二聚体和同源四聚体NAD-IDHs。再历经贫瘠碳源的选择，NAD-IDH祖先蛋白发生了辅酶依赖性的转变，演化出NADP-IDH。
在本研究中，以CsIDH为代表的Ⅰ型原核生物同源四聚体NAD-IDH与真核生物线粒体的异源寡聚体NAD-IDH聚在同一进化支，为线粒体内共生起源学说提供了有力支持。鉴于真核生物线粒体NAD-IDH保持了细菌祖先NAD-IDH的结构特征，因此推测可能包含祖先NAD-IDH(如原核生物四聚体NAD-IDH)的早期细菌被原始真核生物吞噬后，在进化过程中，原核生物四聚体NAD-IDH的编码基因发生了倍增事件。随着时间和环境的变化，两部分同源四聚体NAD-IDH的序列和功能发生了趋异进化，分别演化为真核生物线粒体NAD-IDH的催化亚基和调节亚基。该推测还需更多证据的进一步证明。