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背景与目的胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,全球每年新发胃癌占所有新发癌病例的10%。早期胃癌5年生存率90%,而中晚期胃癌5年生存率仅10-15%,但目前临床上首次就诊的胃癌80%为中晚期。造成这种状况的原因较多,包括早期无明显症状及胃镜检查未普及等,而缺乏特异、敏感、经济的高危人群预警及早期诊断的生物学指标和方法为最主要的原因。KLF家族中KLF5和KLF6在以往研究中被证实为重要的肿瘤抑制基因,但与胃癌及癌前病变关系尚不明确。基于此本课题主要研究KLF5和KLF6在胃癌和癌前病变组织中的表达情况,探讨其与胃癌发生发展及胃癌临床参数的关系,并在蛋白质水平上进行KLF5和KLF6基因表达的相关性分析,明确KLF5和KLF6可做为预测导致III型肠化生和异型增生向癌方向发展的关键基因,以期利于高危人群预警及早期癌的诊断,对提高胃癌生存率并降低死亡率有重要临床应用价值。材料与方法1、标本来源RT-PCR标本收集自2011-10／2012-05郑州大学第二附属医院普外科和胸外科切除的手术标本60例,其中胃癌组织30例,与其对应的正常胃黏膜组织(至少距肿瘤边缘5cm)30例,取新鲜标本置于装有RNA保护液的EP管中,4℃过夜,而后冻存于-80℃超低温冰箱备用。另同期收集郑州大学第二附属医院病理科存档蜡块111例,肠上皮化生45例,异型增生16例,胃癌30例,对照组选取正常胃黏膜组织20例,年龄在21-75岁之间,平均年龄58岁,所有标本均经病理学证实,术前未做任何放疗和化疗,并有完整的临床病理资料,包括性别、年龄、浸润深度、有无淋巴结转移、肿瘤大小及临床TNM分期。分期参照美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)第7版胃癌TNM分期；2、方法采用黏液组织化学、免疫组织化学和RT-PCR方法分别检测KLF5和KLF6在胃癌和癌前病变组织中蛋白及mRNA表达情况；3、统计学处理用SPSS17.0软件进行统计学分析。免疫组化评分参考IRS评分法。统计KLF5和KLF6在不同病变胃黏膜中的表达差异及胃癌组织阳性表达与其临床参数间的差异用四格表X2检验,校正X2检验或Fisher精确概率法。KLF5与KLF6在正常胃黏膜与胃癌组织的基因表达关系用两分类变量的关联性分析。RT-PCR结果进行方差分析后,满足正态分布及方差齐性则用定量资料t检验,方差不齐时使用Kruskal-Wallis检验,偏态时采用Mann-Whitney U秩和检验,结果采用x±S表示。当P<0.05时认为差异有统计学意义。结果1、肠上皮化生组织经HID-AB-PAS染色,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型；Ⅲ型肠上皮化生柱状细胞分泌硫酸黏液,呈棕黑色；Ⅱ型肠上皮化生柱状细胞分泌中性黏液,呈红色；I型肠上皮化生杯状细胞分泌唾液酸黏液,呈蓝色；2、KLF5蛋白的阳性表达在正常胃黏膜组织及肠上皮化生组织中位于细胞浆,细胞膜以及细胞核,而在不典型增生与胃癌组织中,阳性表达位于细胞核,表现为胞核或胞浆内出现弥漫分布棕色、黄色或棕褐色颗粒；KLF5在正常胃黏膜组织、Ⅰ和Ⅱ型肠化、Ⅲ型肠化、异型增生、胃癌中阳性表达率分别为95%(19/20)、83%(25/30)、60%(9/15)、56%(9/16)、37%(11/30),呈逐渐下降趋势；正常胃黏膜的表达与Ⅰ、Ⅱ型肠化二者无显著性差异(X2=0.639,P=0.424)；与Ⅲ型肠化、异型增生、胃癌组织相比较均有显著性差异(X2=4.557,5.643,17.014,P=0.033,0.018,0.000)；KLF5蛋白在胃癌组织细胞核中的阳性表达与患者的性别、年龄、生长部位、组织学分型、有无淋巴结转移无明显关系(X2=0.000,0.578,0.144,1.292,0.314,P=1.000,0.447,0.075,0.256,0.575),但与肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度和肿瘤大小之间均有明显的相关性(X2=3.967,8.623,6.904,P=0.046,0.003,0.009)；其幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染率因原始资料不全未进行统计；3、KLF6蛋白阳性表达在正常胃黏膜和各型肠上皮化生为细胞浆以及细胞核,着深棕色或棕色,而在不典型增生与胃癌组织中,阳性表达位于细胞核,同KLF5,也表现为胞核或胞浆内出现弥漫分布棕色、黄色或棕褐色颗粒；KLF6在正常胃黏膜、Ⅰ和Ⅱ型肠化、Ⅲ型肠化、异型增生、胃癌中阳性表达率分别为90%(18/20)、73%(22/30)、53%(8/15)、50%(8/16)、33%(13/30),也呈逐渐下降趋势；正常胃黏膜的表达与Ⅰ、Ⅱ型肠化二者无显著性差异(X2=1.172,P=0.279)；与Ⅲ型肠化、异型增生、胃癌组织相比较均有显著性差异(X2=4.266,5.236,11.092,P=0.039,0.022,0.001)；其中KLF6蛋白阳性表达与肿瘤分化程度和肿瘤大小之间均有明显的相关性(X2=8.438,4.617,P=0.004,0.032),而与患者的性别、年龄、生长部位、肿瘤浸润程度、组织学分型、有无淋巴结转移无明显关系(X2=0.524,0.314,0.136,0.042,1.222,0.074,P=0.409,0.575,0.713,0.838,0.269,0.785)；其幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染率因原始资料不全未进行统计；4、正常胃黏膜组织中KLF5和KLF6蛋白之间的阳性表达有明显相关性(#=9.497,P值=0.002,关联系数r=0.688)；5、胃癌组织中KLF5和KLF6蛋白之间的阳性表达有明显相关性(X2=10.476,P值=0.001,关联系数r=0.591)；6、KLF5mRNA的表达在胃癌中低于正常组织,KLF5mRNA在正常胃黏膜和胃癌组织中表达水平分别是0.62±0.22,0.60±0.15,不满足正态分布,Mann-Whitney U值为402.0,P值为0.478,差异无统计学意义；7、 KLF6mRNA的表达在胃癌中低于正常组织,KLF6mRNA在正常胃黏膜和胃癌组织中表达水平分别是0.60±0.28,0.58±0.20,不满足正态分布,Mann-Whitney U值为426.0,P值为0.723,差异无统计学意义。结论1、相较于正常胃黏膜,胃癌组织中存在KLF5和KLF6基因表达的下调,提示其异常表达与胃癌发生密切相关；在胃癌低分化组织及大于5cm胃癌组织中表达显著下调,提示其异常表达与胃癌进展密切相关；2、在III型肠化生及异型增生组织中,KLF5和KLF6基因表达相较于正常组织显著下调,提示III型肠化生及异型增生,特别是KLF5和KLF6表达下调者可能更具癌变潜能,加强对其临床随访可有利于提高早期胃癌诊断率,具有重要临床应用价值；3、胃癌组织中KLF5和KLF6蛋白表达之间具有明显的正相关,KLF5和KLF6蛋白在细胞中可能具有协同作用。