目的:神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种由多种因素引发的疾病,给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担,严重影响着人口质量,但其发生机制并未完全阐明。体外全胚胎培养(Whole embryo culture,WEC)是可以实现高度模拟子宫内胚胎暴露于特定环境的一项技术,通过精准控制遗传和环境因素、精确定位神经管闭合相对狭窄的窗口期、缩小与母婴遗传相关敏感性差异等优势,为研究神经管畸形发病机制提供了便利途径。卵黄囊血循环建立早于神经系统和心血管系统形成,它的发育程度决定着胚胎发育速度,有研究表明卵黄囊发育与胚胎畸形率呈负相关,课题组拟利用WEC平台研究NTDs的发生机制,为干预神经管畸形发生提供新思路。本研究目的主要内容有:1利用小鼠体外WEC平台将E(embryo,E)7.0胎鼠体外培养5天,并在神经管闭合阶段详尽研究其形态学发生。2利用小鼠体外WEC平台分别建立丙戊酸、酒精、stavudine致NTDs模型并研究其发生机制;3利用小鼠体外WEC平台建立高糖诱导NTDs模型并探讨二甲双胍干防效果及机制。方法:1将E 7.0胎鼠体外培养5天和E 8.5胎鼠体外培养2天。1.1采用乙醚麻醉大鼠,腹主动脉采血,即刻离心取上清,制备WEC所需培养基。1.2打开孕鼠腹腔取出子宫,分别提取E 7.0和E8.5胚胎,保持外胎盘锥、脏层卵黄囊、羊膜以及胚胎的完整性;对于E 10.5提取需要保持卵黄囊、胚胎以及脐带的血循环的完整性。1.3将胚胎移入培养基中,充好相应混合气体,37℃滚动无菌培养,观察胚胎卵黄囊血循环及胚胎发育情况。2应用小鼠WEC平台分别建立丙戊酸、酒精、stavudine致NTDs模型并研究其发生机制。2.1提取E 8.5胚胎37℃孵育半小时后,培养基中加入VAP 0.6 mM/ml,连续培养24h后,应用Van-Maele-Fabry评分系统对卵黄囊循环评分并记录NTDs发生率;提取E 8.5胚胎37℃孵育半小时后,加入95%酒精6μl/ml连续培养24h,观察胚胎发育情况拍照,对卵黄囊循环评分并记录NTDs发生率;提取E 8.5胚胎37℃孵育半小时后培养基中分别加入0、5、10、15μM-stavudine,续培养48h,观察胚胎发育情况拍照,并对体节、头臀长、卵黄囊大小以及NTDs发生率进行记录,同时应用Van-Maele-Fabry对胚胎各器官及卵黄囊血循环进行评分。最后应用免疫组化技术以及WB在培养结束后对胚胎分别进行增殖和凋亡的定性和定量检测。2.2对丙戊酸、酒精、stavudine致NTDs模型的卵黄囊进行组织结构、增殖与凋亡的定性与定量分析。3利用小鼠WEC平台建立高糖诱导神经管畸形模型并应用二甲双胍进行干预。3.1提取E 8.5胚胎37℃孵育半小时后,对照培养基含葡萄糖100μg/ml(正常血清血糖浓度),高糖处理组的培养基中加入300μg/ml葡萄糖(模仿糖尿病血清血糖浓度),记录胚胎神经管畸形发生率,并应用免疫组化以及WB技术对卵黄囊以及胚胎头部进行PCNA和CC3定性和定量检测。3.2提取E 8.5胚胎37℃孵育半小时后,对照培养基含葡萄糖100μg/ml,二甲双胍处理组浓度分别100μg/ml和200μg/ml,连续培养24h后记录胚胎神经管畸形发生率,评估卵黄囊直径以及血循环的发育状况。3.3提取E 8.5胚胎37℃孵育半小时后,对照培养基含葡萄糖100μg/ml,高糖处理组的培养基中加入300μg/ml葡萄糖,二甲双胍干预组加入二甲双胍浓度为100μg/ml h或200μg/ml到高糖条件的培养基中,连续培养24h,观察胚胎神经管闭合情况拍照,记录胚胎发生神经管畸形率,同时对胚胎应用WB技术进行PCNA和CC3定量检测。结果:1成功将E 7.0胚胎体外培养5天和仔细观察E 8.5体外培养两天胚胎发育变化。1.1我们详细描述了提取E 7.0、E 8.5和E 10.5小鼠胚胎的方法和制备即刻离心血清的技术,展示了E 7.0体外培养5天的胚胎每24h记录的结果;1.2 E 8.5连续培养2天的胚胎,每隔4h我们记录一次胚胎形态,有包含卵黄囊以及去除卵黄囊两种形态,同时制作了胚胎转体、神经管、前后肢芽评分图,尤其是卵黄囊血循环建立彩色评分图。2利用小鼠体外WEC平台建立丙戊酸、酒精、stavudine致NTDs模型并研究其发生机制。2.1卵黄囊血循环评分结果显示:与对照组相比,E 8.5胚胎经VAP培养24h后导致胚胎卵黄囊血循环评分显著下降,外观苍白、血管网稀疏、大血管稀少,斑片状分布,胚胎发育迟缓,胚胎NTDs率升高。与对照组相比,E 8.5胚胎经酒精培养24h后胚胎卵黄囊血循环在形态学方面:血循环建立差,血管极未形成,丰富的血管树状丛未形成,斑块状分布,整体表面苍白,且评分降低,胚胎NTDs发生率升高。E 8.5胚胎在stavudine浓度分别为0、5、10、15μM续培养48h后胚胎体节、头臀长、卵黄囊大小随着浓度的增加而减少,随着处理浓度的增加而胚胎死亡率增加,并对胚胎器官进行评分。而在5μM-stavudine处理组胚胎NTDs发生率显著升高。与对照组相比,免疫组化和WB结果表明用VAP、酒精、5μM-stavudine、分别诱导NTDs胚胎均显示增殖下降,凋亡增加。2.2丙戊酸、酒精、stavudine诱导的NTDs胚胎的卵黄囊在增殖与凋亡与其诱导的NTDs胚胎变化趋势方面基本保持一致。3利用小鼠WEC平台建立高糖诱导神经管畸形模型并应用二甲双胍对高糖诱导NTDs进行干预。3.1与对照组相比,培养基内加入300μg/ml葡萄糖模仿体内高血糖状态,导致胚胎神经管畸形发生率明显增加,卵黄囊血循环评分下降。卵黄囊和胚胎的免疫组化定性研究PCNA阳性细胞数下降而CC3阳性细胞数增加,WB实验也证实了一致结果。3.2二甲双胍浓度实验表明:对照组与二甲双胍在浓度为100μg/ml时胚胎神经管延迟闭合的发生率无区别,卵黄囊直径以及血循环评分也无统计学意义的差异;在二甲双胍浓度为200μg/ml时胚胎卵黄囊直径以及血循环评分与对照组无统计学差异,但是神经管未闭合率增加,有统计学意义。3.3探索二甲双胍干预高糖诱导神经管畸形发生结果显示:高糖条件下二甲双胍浓度为100μg/ml胚胎神经管畸形发生率明显下降,且卵黄囊血循环明显改善,评分上升,WB实验结果表明二甲双胍100μg/ml治疗组胚胎PCNA和CC3表达与正常组相似,而高糖组与二甲双胍治疗组相比:PCNA含量下降,CC3含量增加。二甲双胍浓度为200μg/ml可干预高糖诱导胚胎NTDs发生,包括卵黄囊发育障碍,但是偶有心包膨大发生。结论:1成功利用WEC平台将E 7.0胚胎体外培养5天,符合相关评分标准,对E 8.5胚胎体外培养24小时详细观察胚胎发育形态学变化。2丙戊酸、酒精和stavudine通过增殖和凋亡诱导胚胎NTDs发生,且均伴有卵黄囊发育障碍,在形态学、组织结构学、增殖与凋亡方面均发生不同程度的改变。3成功建立高糖诱导胚胎神经管畸形模型,该条件下卵黄囊与NTDs胚胎均有增殖和凋亡水平的改变。二甲双胍在一定范围内不影响胚胎及其卵黄囊发育的形态学变化,浓度为100μg/ml的二甲双胍可以干预高糖诱导神经管畸形的发生和改善卵黄囊血循环障碍,在增殖与凋亡蛋白的表达水平接近正常胚胎。