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第一部分应用HRM技术对CYP2C19*2和CYP2C19*3进行双重SNP分型氯吡格雷是一种广泛用于预防静脉血栓形成的抗血小板药物。研究表明,携带有CYP2C19基因功能缺失型等位基因CYP2C19*2、CYP2C19*3的病人,其体内代谢氯毗格雷成为其活性形式的能力降低,导致氯吡格雷抑制血小板聚集功能减弱。本研究旨在建立一种利用高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melting curve analysis, HRM)技术在闭合单管中同时对CYP2C19*2、 CYP2C19*3两个多态性位点进行简便、准确分型的方法。本实验针对两个SNIP位点分别设计特异性的HRM引物,并在两个位点引物的5’端分别加上富含AT和GC的序列,保证两个位点的扩增产物熔解峰无重叠。利用HRM技术,我们快速、灵敏的对64例随机DNA样本的CYP2C19*2、CYP2C19*3两个多态性位点进行了基因分型,且HRM方法的分型结果与测序验证结果完全一致。因此,利用HRM技术可以实现在闭合单管中简便、准确地对CYP2C19*2、CYP2C19*3两个多态性位点同时进行基因分型。该方法有望应用于临床,指导氯吡格雷的个体化用药。第二部分TALEN介导的小鼠p53基因修饰TALEN是由植物病原菌——黄单胞菌的转录激活因子样效应物(transcription activator-like effectors TALE)蛋白的DNA结合结构域和FokI核酸酶的DNA非特异性切割结构域构成的内切核酸酶。TALEN可以特异性识别并切割DNA序列,引起DNA双链断裂,从而引发非同源末端连接和同源重组,目前广泛应用于基因定点修饰和定点突变。本课题旨在利用TALEN技术,实现对小鼠细胞p53基因进行定点修饰。我们设计了针对小鼠p53基因序列的特异性酵母系统TALEN表达载体PTAL3-TALEN F、PTAL3-TALEN R,哺乳动物细胞TALEN表达载体pcDNA3.1-TALENF, pcDNA3.1-TALENR,酵母系统中TALEN切割效率检测质粒pGBKT7-TAL site和同时带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性基因的p53基因打靶载体p53-TV。将PTAL3-TALEN F, PTAL3-TALEN R, pGBKT7-TAL site质粒同时转化酵母细胞,对TALEN的切割效率进行检测,得到TALEN的切割效率约为3.5%。将pcDNA3.1-TALENF、pcDNA3.1-TALENI洪转染NIH3T3细胞,并利用HRM技术成功检测到基因突变。将pcDNA3.1-TALENF、pcDNA3.1-TALENR、p53-TV质粒共NIH3T3细胞,转染后48小时,观察重组后细胞的GFP表达状况,并加入终浓度8μ g/ml的嘌呤霉素的筛选重组细胞。筛选后重组细胞扩大培养,进行PCR鉴定和细胞周期检测。我们获得了同时具有嘌呤霉素抗性和表达GFP的细胞,且细胞形态差异较大,存在多核细胞。PCR鉴定和基因测序结果表明,断裂的p53基因与供体DNA发生位点特异性重组。细胞周期检测结果表明,p53基因重组后表达受到抑制,引起细胞周期阻滞。因此,TALEN技术可以应用于活体细胞的基因修饰,为后续遗传性疾病的基因治疗和基因突变育种提供理论和技术依据。