研究背景临床上,由于结石、狭窄、肿瘤等原因引起输尿管梗阻,导致尿液排出受阻,肾盂肾盏等集合系统扩张,肾脏发生间质水肿,局灶性炎症细胞浸润,肾小管纤维化等病理变化,肾脏功能受损,即使上尿路梗阻解除,部分病例仍出现患肾逐渐萎缩。许多学者的研究证实了细胞凋亡在单侧输尿管结扎模型间质纤维化进展中的作用,在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型中,梗阻侧肾脏肾小管上皮细胞在梗阻1周后出现明显的凋亡细胞及凋亡小体,氧自由基介导的细胞凋亡参与了尿路梗阻后肾脏病理改变。进一步研究发现输尿管梗阻后,肾小管和肾间质细胞凋亡均增加,而且凋亡调控因子Bcl-2和Bax也主要表达于肾小管上皮细胞,前者表达减少、后者表达增多,提示二者共同调节肾小管细胞凋亡,肾小管细胞凋亡可能是梗阻性肾萎缩主要原因。随着现代医学发展,分泌性尿路造影(IVU)、增强CT, CTU目前是上尿路梗阻性疾病诊断中的主要影像学检查方法,检查过程中需要使用造影剂,大量的临床和基础研究都已经证实,造影剂对肾脏存在潜在损害可能,造影剂急性肾损害(contrast-induced acute kidney injury, CI-AKI)是急性肾损伤的重要原因之一,CI-AKI发病率报告不一,从0%～58%不等,预后差、并发症发生率高、已成为住院患者急性肾衰竭的第三大致病因素。目前普遍认为CI-AKI的发病是多因素所致,其发病机制可能在于以下三个方面：造影剂诱导肾血管收缩、通过氧化应激增加氧自由基和直接肾小管毒性。在造影剂相关性肾损害危险因素分析中,术前肾功能异常、术前合并2型糖尿病、术前补液量过低及造影剂用量过大等是导致CI-AKI发生的重要原因。肾功能不全是CI-AKI发生的最危险因素,肾功能不全时肾脏代偿能力下降,易致成CI-AKI,其发病率随Scr水平上升而增高,Scr水平为106.1256.4umol/L时,CI-AKI的发病率为4%-20%,有研究表明当患者肾小球滤过率(GFR)小于60m1/min·1.73M2时,CI-AKI发病率显著上升。因此,《中国泌尿外科疾病诊疗指南》中把Scr大于256.4umol/L作为接受造影剂注射的禁忌。对于单侧输尿管梗阻引起的肾积水而言,患肾的肾功能属于不同程度受损的状态,导致患肾肾小球滤过率(GFR)明显下降,根据现有文献理论推测,此时造影剂的应用有可能在其原本肾脏受损的情况下加剧肾小管的细胞毒性,加速肾小球、肾小管纤维化,甚至对解除梗阻后的恢复产生不良的影响：造影剂会刺激肾脏产生氧自由基,大量证据表明这些活化的氧自由基是肾损伤的重要因素。临床上经常看到,单侧输尿管完全性梗阻的肾积水患者在进行IVU、增强CT、CTU检查后1-2天再做CT平扫,梗阻肾仍有大量造影剂蓄积,根据造影剂具有肾损害的特性,推测这种造影剂蓄积在一定程度上可能会加重造影剂肾损害的病理过程,这种病理过程有可能会影响解除梗阻后肾脏的预后,即临床上常见的肾萎缩。对于这种损害过程的防治措施,除了在使用造影剂时,应严格挑选适应证,严格掌握造影剂剂量(包括造影剂种类和减少造影剂剂量)以外,大量研究集中于抗血管收缩作用、增强肾单位血流量或抗氧自由基损伤等；对于造影剂肾损害的治疗方法及药物主要包括水化疗法、血液滤过、预防性透析、碳酸氢钠、腺苷受体抑制剂、多巴胺、利尿剂、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、钙离子拮抗剂、内皮素受体抑制剂以及心钠素、血管紧张素转换酶抑制剂、L-精氨酸、类胰岛素生长因子、前列腺素E1等。由于NAC具有较强的抗氧化作用,成为了目前比较公认的造影剂肾损害的保护性药物。本研究是基于上述临床中所发现的问题和推测,通过动物模型、药物干预和临床观察等三个方面,探讨造影剂对单侧输尿管梗阻肾脏的损害机制,研究中选择血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平评估肾脏损害程度。第一章造影剂对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏的影响目的：本部分利用可复性完全性单侧输尿管梗阻的动物模型模拟临床上的单侧肾积水病理生理变化,尾静脉注射碘海醇模拟临床实践中影像学检查时使用的造影剂,选择公认的早期肾损害的敏感指标NGAL来评估肾损害情况,再以肾小管细胞凋亡率和Bax mRNA表达情况初步探讨这种肾损害的可能机制。方法：SPF级SD大鼠42只,随机分为假手术组(14只)与模型组(28只),模型组使用“V管”法制备可复的完全性左侧输尿管梗阻动物模型,假手术组只行切开、分离,不夹闭输尿管；3周后动物模型成熟,将模型组动物随机再分为造影剂组(14只)与对照组(14只),在第22天,造影剂组大鼠尾静脉注射碘海醇(3000mg/kg体重),对照组注射等量生理盐水(NS),假手术组不注射药物,1天后(即第23天)三组分别取7只大鼠抽血分离血清检测血清NGAL水平,处死后取材检测肾脏形态学及病理变化、肾小管细胞凋亡率及肾组织BaxmRNA的表达；各组剩余7只大鼠,模型组手术解除梗阻,假手术组仍只切开、分离、缝合；解除梗阻后3周执行上述的检测项目。统计学处理：采用IBM SPSS Statistics 21.0软件分析处理。计量资料统计描述用均数、标准差(mean、SD)表示。造影剂对不同分组和不同时间点大鼠左右肾的影响采用重复测量方差分析法检验,造影剂对不同分组和时间点大鼠的影响采用析因设计的方差分析法检验,单独效应分析基于析因分析后均数LSD校正的结果,方差不齐时使用Welch检验结果,P<0.05为差异有统计学意义。结果：模型组大鼠(造影组和对照组)在用药后第1天(造模后第23天)左肾体积比右肾显著增大(P<0.05),左肾实质厚度较右肾显著变薄(P<0.05),提示复制模型成功；模型组大鼠解除梗阻3周后左肾体积解除梗阻前比较明显缩小(P<0.05),说明梗阻解除成功。病理变化方面,大鼠右侧肾脏镜下未见明显异常,大鼠左侧肾脏镜下见肾脏皮质变薄；肾小球萎缩、数目减少；部分肾小管扩张,肾小管上皮细胞扁平化,少量肾小管内见蛋白管型、细胞管型；部分肾小管管腔塌陷,肾小管上皮细胞空泡化；肾间质炎细胞浸润；肾间质纤维化加重,与模型组比较造影组大鼠肾脏皮质损伤无显著性差别；模型组、造影组大鼠左肾肾小球数目均较右肾显著减少；造影组在注射造影剂后第1天、解除梗阻后3周左肾肾小球数目分别与模型组比较未见差异。造影组大鼠在用药后第1天、解除梗阻后3周血NGAL水平与对照组比较显著升高(P<0.05)。在用药后第1天、解除梗阻后3周造影组和对照组大鼠左肾细胞凋亡率及Bax mRNA表达量均较右肾增高(P<0.05)；解除梗阻后3周造影组大鼠左肾细胞凋亡率及BaxmRNA表达量均较对照组增高(P<0.05)。结论：造影剂对肾脏的作用主要表现在三个方面：其一：改变肾脏血流动力学,造影剂对肾脏血流改变呈双相反应,开始肾血流短暂扩张,血流增加,继而出现持续的进行性血管收缩,引起血流从髓质到皮质的重新分布,使髓质血流减少,出现缺血表现；其二：缺血缺氧损伤发生时,组织灌注不足产生的活性氧自由基(ROS),超过了机体的抗氧化储备,进一步加剧缺血性肾损伤；其三,直接损害肾小管上皮细胞,降低肾小管三磷酸腺苷、总腺嘌呤核苷酸及钾离子的含量,同时提高肾小管细胞内的钙离子,从而使肾小管的基础及解耦合呼吸率减少,损害肾小管细胞线粒体,影响细胞色素释放和质膜破坏。所有这些病理过程共同结果是肾髓质缺血,缺血性损伤上调了NGAL蛋白的表达,并且在大鼠血清表现出NGAL含量的升高；肾小管上皮细胞BaxmRNA的表达上调介导了过度的细胞凋亡,这可能是造影剂对单侧肾积水大鼠肾脏损伤的重要机制之一。第二章N-乙酰半胱氨酸对单侧肾积水大鼠造影剂肾损害的保护作用目的：本部分在前期研究基础上,使用具备抗氧自由基作用的N-乙酰半胱氨酸(NAC)对单侧肾积水模型大鼠造影剂肾损害过程进行药物干预,仍以早期肾损害的敏感指标NGAL来评估肾损害变化情况,再以肾小管细胞凋亡率和Bcl-2mRNA表达情况初步探讨NAC对造影剂肾损害保护的可能途径。方法：雄性SD大鼠68只,同法制备可复性完全性左侧输尿管梗阻动物模型,3周后模型成熟,然后模型动物随机均分为3组,NAC组(24只),生理盐水组(NS组,24只)与对照组(20只),前两组分别以NAC、等量的NS灌胃3天,对照组不灌胃。3天后NAC组和NS组模型大鼠注射碘海醇(3000mg/kg体重),对照组注射等量NS；注射药物1天后,各组取半数大鼠处死取材检测肾脏形态学变化、血清NGAL、肾小管细胞凋亡率及肾组织Bcl-2 mRNA表达；剩余大鼠手术解除输尿管梗阻,3周后处死,同样作上述项目检测。统计学处理：采用IBM SPSS Statistics 21.0软件分析处理。计量资料统计描述用均数、标准差(mean、SD)表示。造影剂对不同分组和不同时间点大鼠左右肾的影响采用重复测量方差分析法检验,造影剂对不同分组和时间点大鼠的影响采用析因设计的方差分析法检验,单独效应分析基于析因分析后均数LSD校正的结果,方差不齐时使用Welch检验结果,P<0.05为差异有统计学意义。结果：注射造影剂的NAC组和NS组用药后第1天,血清NGAL含量均较对照组显著升高(P<0.05), NAC组大鼠血清NGAL水平低于NS组(P<0.05),三组左肾肾小管细胞凋亡率及Bcl-2 mRNA表达比较无显著性差异(P>0.05)；解除梗阻后3周,各组NGAL水平较前均无显著性变化(P>0.05), NAC组左肾肾小管细胞凋亡率及Bcl-2 mRNA表达均高于对照组,但低于NS组(P<0.05)。结论：前期研究已初步证实造影剂会引起肾髓质缺血性变化,缺血损害产生大量氧自由基,氧自由基损伤介导了细胞凋亡,细胞凋亡是造影剂影响细胞活性的主要原因,基于这种机制,作为抗氧化剂的NAC含巯基(-SH),可以灭活活性氧簇(ROS),直接发挥抗氧化作用,可以促进谷胱甘肽合成,通过后者间接发挥抗氧化作用,还可通过NO和S-亚硝基硫醇发挥血管扩张作用、抑制血管紧张素转化酶的生成和稳定NO等机制来减少造影剂对肾功能的影响；使用造影剂前应用NAC的大鼠减轻了肾损伤的程度,NGAL指标较NS组降低,而且在解除梗阻3周后,NAC组左侧肾小管上皮细胞Bcl-2 mRNA表达高于NS组,而细胞凋亡率低于NS组,提示NAC对单侧肾积水大鼠中造影剂引起的肾损害的具有一定的保护作用,这一过程可能是通过上调Bcl-2 mRNA表达抑制肾小管细胞凋亡来实现的。第三章造影剂对单侧输尿管梗阻患者血清NGAL水平的影响及意义目的：利用之前基础研究中使用的早期肾损害敏感指标NGAL检测临床上接受造影剂注射的单侧输尿管完全梗阻患者肾损害情况,试图观察基础研究中发生在模型大鼠血清NGAL含量变化是否同样在人体得到验证,进而初步探讨造影剂对患者肾脏损害的机制。方法：临床单侧输尿管完全梗阻(ⅣU或CTU证实)患者36例；对照组为同期住院病人,无输尿管梗阻25例；两组患者均排除高血压、糖尿病、高尿酸血症、近期体外碎石治疗史等其他肾损害因素；两组患者均在使用造影剂前、使用造影剂后2小时留取血清,检测肾功能Cr及NGAL。统计学处理：采用IBM SPSS Statistics 21.0软件分析处理。计量资料统计描述用均数、标准差(mean、SD)表示。计量资料统计描述用均数、标准差(mean、SD)表示。患者造影前后的组内比较采用配对t检验,同一状态下的组间均衡性比较采用两独立样本t检验。结果：单侧输尿管梗阻患者注射造影剂前血清NGAL含量较对照组增高(P<0.05),使用造影剂后2小时血清NGAL含量较注射前增高(P<0.05)；对照组患者用药前、后血清]NGAL含量比较无显著性差异(P>0.05)。结论：单侧输尿管完全梗阻造成肾盂压力增高,一系列病理生理变化最终引起肾脏缺血改变,缺血性损伤导致NGAL蛋白在肾单位多处表达上调,NGAL蛋白转运铁到近端肾小管细胞,在铁作用下血红素加氧酶-1表达上调,进而发挥保护作用,且NGAL蛋白的量与缺血程度、缺血持续时间成正比,因此在单侧输尿管完全梗阻患者使用造影剂前就表现出早期肾损害的敏感指标血清NGAL水平升高,而注射常规剂量的造影剂加剧了这一损害的程度,与动物实验结果相似。但这种损害并没有引起综合肾功能的变化,可能与对侧肾脏强大的代偿功能有关。造影剂对积水肾的这种损害是一过性抑或是持续性?是否会对解除梗阻后患肾的转归产生影响?动物实验中的肾损害保护性药物N-乙酰半胱氨酸(NAC)对这一过程是否也有作用?这些问题都有待进一步的深入研究。