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目的:脓毒症是因为感染引起宿主反应失调进而导致危及生命的器官功能障碍,是重症监护病房常见的疾病之一。脓毒性休克作为脓毒症的一种亚型,具有更高的病死率。脓毒症心肌损伤是脓毒性休克常见的并发症,其发生促进了脓毒性休克的进展与恶化,是导致死亡的重要原因。因此,明确脓毒症心肌损伤的发病机制有助于临床医生找到新的治疗靶点,降低患者的病死率。脓毒症心肌损伤发病机制复杂,目前尚无一种或几种理论可以完全阐明。最广为接受的理论是多种因素相互作用,共同参与脓毒症心肌损伤的发病过程。包括炎症因子、细胞凋亡、线粒体功能障碍等。近年,研究表明,细胞焦亡也可能参与脓毒症心肌损伤的发生发展过程。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是在真核生物中发现的一类长度超过200个核苷酸、没有长开放阅读框的RNA。近年,越来越多的研究表明lncRNAs可以在表观遗传、转录以及转录后等多水平调控基因的表达,进而参与多种重要的生物学过程。研究发现,多种lncRNAs参与到脓毒症的发病机制中。但是,lncRNA与脓毒症心肌损伤的研究很少。课题组前期对脓毒性休克大鼠心肌组织进行了全转录组测序,结果显示炎症与凋亡相关通路和基因呈现显著富集。同时测序结果显示,lncRNA-AABR07066529.3在模型组表达显著升高,并且可能与炎症、细胞凋亡与细胞焦亡通路相关。此外,生信分析表明,髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）可能是lncRNA-AABR07066529.3的靶基因。MyD88是一种经典的连接蛋白,在多种炎症相关疾病中都参与炎症与凋亡的调控。此外,有研究报道,MyD88可以影响NLRP3炎症小体的表达,说明MyD88也参与细胞焦亡的调控。基于以上背景,本课题拟研究在脓毒症心肌损伤中,lncRNAAABR07066529.3是否可以通过调节炎症、细胞凋亡与细胞焦亡影响心肌细胞损伤,并探究lncRNA-AABR07066529.3发挥作用的具体机制。研究方法:第一部分:脓毒性休克大鼠心肌损伤模型中炎症、细胞凋亡和细胞焦亡情况及lncRNA-AABR07066529.3的验证1、将幼年Wister大鼠分为对照组和脓毒症心肌损伤组。LPS（20mg/kg）腹腔注射构建脓毒症心肌损伤模型,对照组给予等量生理盐水。12h后取材,HE染色观察心肌组织损伤情况。2、不同浓度LPS处理H9c2心肌细胞不同时间,CCK8检测心肌细胞活力情况,确定LPS干预的最佳干预浓度和时间。3、炎症损伤的检测。Luminex多因子技术检测各组大鼠腹主动脉血中炎症因子TNF-α与IL-6的含量;并用Western blot检测各组细胞中TNF-α与IL-6的表达情况。4、细胞凋亡的检测。Tunel染色检测各组大鼠心脏组织中细胞凋亡的情况;流式细胞技术检测各组细胞中细胞凋亡率的变化;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase3的表达情况。5、细胞焦亡的检测。Luminex多因子技术检测各组大鼠腹主动脉血中炎症因子IL-1β与IL-18的含量;电镜观察大鼠心肌组织损伤情况;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT的表达情况。6、PCR检测各组大鼠心脏组织以及各组H9c2心肌细胞中lncRNA-AABR07066529.3的表达情况。7、网站预测（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lnc Locator/）lncRNA-AABR07066529.3的细胞定位,并利用荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybrid ization,FISH）实验验证。Northern blot实验观察lncRNA-AABR07066529.3大小,c DNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of c DNA ends,RACE）实验获取lncRNA-AABR07066529.3全长。第二部分:lncRNA-AABR07066529.3对LPS诱导的H9c2心肌细胞的作用1、利用慢病毒构建lncRNA-AABR07066529.3敲减载体,荧光显微镜观察转染情况,PCR检测敲减效率。将细胞分为四组:对照组、LPS组、LPS+NC-KD以及LPS+KD组。流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化情况。Western blot检测各组细胞中炎症因子TNF-α与IL-6、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase3以及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT的表达情况。2、利用腺病毒构建lncRNA-AABR07066529.3过表达载体,PCR检测过表达效率。将细胞分为四组:对照组、LPS组、LPS+NC-OE组以及LPS+OE组,检测心肌细胞中炎症、细胞凋亡及细胞焦亡的变化情况。第三部分:lncRNA-AABR07066529.3在脓毒症心肌损伤中发挥作用的可能机制1、Western blot检测MyD88在各组大鼠心脏组织以及各组H9c2心肌细胞中的表达情况。2、利用si-RNA构建MyD88敲减载体,进行PCR和Western blot检测敲减效率。利用Western blot实验检测各组细胞中炎症、细胞凋亡以及细胞焦亡相关蛋白的表达变化情况。明确MyD88对LPS诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响。3、lncRNA-AABR07066529.3敲减/过表达后,Western blot检测MyD88的表达变化,观察lncRNA-AABR07066529.3对MyD88的调控作用。4、进行同时敲减lncRNA-AABR07066529.3和MyD88的回复实验,验证lncRNA-AABR07066529.3通过MyD88发挥作用。将细胞分为LPS+KD+si-NC组以及LPS+KD+si-MyD88组,Western blot检测各组细胞中炎症因子、细胞凋亡以及细胞焦亡相关蛋白的表达变化情况。5、进行RNA pulldown实验,深入探究lncRNA-AABR07066529.3与MyD88的调控机制。研究结果:第一部分:脓毒性休克大鼠心肌损伤体内外模型均存在炎症、细胞凋亡以及细胞焦亡损伤。lncRNA-AABR07066529.3在脓毒症心肌损伤体内外模型中表达升高,且主要表达于细胞质。1、LPS作用1-2小时后,脓毒性休克组大鼠MAP和心功能下降,且达到休克水平（MAP下降>20-25%）。HE染色显示与对照组相比,脓毒性休克组大鼠心脏组织中炎症浸润增多、心肌纤维断;当LPS浓度达到10mg/ml（24h）时,H9c2心肌细胞活力显著下降,且光镜下可见LPS处理组细胞较对照组分布稀疏、细胞皱缩。表明脓毒症心肌损伤体内外模型构建成功。2、Luminex多因子实验发现模型组大鼠腹主动脉血中TNF-α、IL-6、IL-1β与IL-18含量高于对照组（P<0.05）;Tunel染色显示脓毒症心肌损伤组大鼠心脏组织中细胞凋亡增多（P<0.05）;且电镜下在模型组心肌组织中可以观察到凋亡小体与焦亡小体。与对照组细胞相比,Western blot实验发现LPS处理组细胞中TNF-α与IL-6、促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3以及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT的表达增加（P<0.05）而抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少（P<0.05）;流式细胞技术结果也显示LPS后心肌细胞凋亡增加（P<0.05）。表明脓毒症心肌损伤体内外模型中均存在炎症、细胞凋亡与细胞焦亡损伤。3、PCR结果显示lncRNA-AABR07066529.3在LPS诱导的脓毒症心肌损伤体内外模型中表达均增加,与测序结果一致。4、网站预测和FISH实验皆表明lncRNA-AABR07066529.3主要位于细胞质中。此外,Northern Blot与RACE实验发现lncRNA-AABR07066529.3全长为4786nt。第二部分:lncRNA-AABR07066529.3可以抑制LPS诱导的H9c2细胞中炎症、细胞凋亡与细胞焦亡1、PCR筛选敲减效率最高的慢病毒载体（p<0.005）,并用嘌呤霉素成功筛选lncRNA-AABR07066529.3敲减的H9c2稳转细胞株用于后续实验。2、与LPS组和LPS+NC组相比,LPS+KD组中炎症因子TNF-α和IL-6、促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3以及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT蛋白表达增加（P<0.05）,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达减少（P<0.05）。同时,流式实验也显示LPS+KD组细胞凋亡增加（p<0.005）。说明抑制lncRNA-AABR07066529.3后,炎症、细胞凋亡和细胞焦亡增加,提示lncRNA-AABR07066529.3可以抑制LPS引起的H9c2心肌细胞中的炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤。3、PCR筛选过表达效率最高的腺病毒载体,成功过表达lncRNAAABR07066529.3（P<0.05）。与敲减相反,lncRNA-AABR07066529.3过表达后,炎症因子TNF-α和IL-6、促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3以及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT蛋白表达减少（P<0.05）,而抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达增加（P<0.05）,进一步表明lncRNA-AABR07066529.3可以抑制LPS引起的H9c2心肌细胞中的炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤。第三部分:在H9c2心肌细胞中,lncRNA-AABR07066529.3通过抑制MyD88抑制LPS引起的炎症、细胞凋亡与细胞焦亡损伤。1、在脓毒症心肌损伤体内外模型中,MyD88蛋白表达均增加（P<0.05）。2、PCR和Western blot筛选敲减效率最高的si-RNA,成功敲减MyD88（P<0.05）。与LPS组和LPS+si-NC组相比,LPS+si-MyD88组中TNF-α、IL-6、Bax、cleaved-caspase3、NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT表达减少（P<0.05）,而Bcl-2表达增加（P<0.05）,表明MyD88可以加重LPS引起的H9c2心肌细胞中的炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤。3、敲减lncRNA-AABR07066529.3后,MyD88蛋白表达增加（P<0.05）;而lncRNA-AABR07066529.3过表达后,MyD88蛋白表达减少（P<0.05）,说明lncRNA-AABR07066529.3可以抑制MyD88的表达。4、与单独敲减lncRNA-AABR07066529.3相比,同时敲减lncRNAAABR07066529.3和MyD88时炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤减轻（P<0.05）,提示lncRNA-AABR07066529.3可能是通过MyD88发挥作用的。5、RNA pull-down结果中没有获得MyD88,提示lncRNA-AABR07066529.3不是通过与MyD88直接结合发挥作用。研究结论:1、在LPS诱导的脓毒症心肌损伤体内外模型中,均存在炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤。lncRNA-AABR07066529.3在LPS诱导的脓毒症心肌损伤体内外模型中表达升高。2、在H9c2心肌细胞中,lncRNA-AABR07066529.3过表达可以抑制LPS引起的炎症、细胞凋亡与细胞焦亡损伤。3、在LPS诱导的H9c2细胞中,lncRNA-AABR07066529.3通过抑制MyD88的表达,抑制炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤,发挥保护作用