目的:膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其特点是具有多发灶,易复发,易进展。在我国,膀胱癌的发病率位居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第二位。膀胱癌患者在行膀胱切除术后会辅以放化疗等系统性治疗。然而膀胱癌患者经过一段时间的化疗,常产生耐药性,降低治疗的疗效。因此深入研究膀胱癌发病以及产生耐药的分子机制仍然是预防,早期诊断以及治疗膀胱癌的关键。RASSF8基因属于Ras相关结构域家族成员,其主要功能包括参与调控细胞信号通路,细胞周期,微管网络以及细胞凋亡等。已有文献报道RASSF8表达异常与多种类型的恶性肿瘤有关联,包括胃癌,肠癌,宫颈癌,非小细胞肺癌,卵巢癌以及骨肉瘤等,但RASSF8在膀胱癌中的研究报道还较少。在本文中我们将探讨RASSF8在膀胱癌中的表达,以及其在肿瘤细胞增殖,侵袭,凋亡,尤其是耐药方面发挥的作用及潜在分子生物学机制。研究方法:1.生物信息学分析:我们首先下载TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中膀胱癌RASSF8 m RNA的表达数据,其中膀胱肿瘤组织414例,正常膀胱上皮组织19例,通过Prism软件对肿瘤组织及健康组织中RASSF8表达差异进行统计分析（Mann-Whitney test）。2.RASSF8在膀胱癌组织和细胞中的表达:将收集到的膀胱癌及癌旁正常组织,通过免疫组织化学方法分析样本中RASSF8的蛋白表达水平。常规培养膀胱上皮细胞以及膀胱癌细胞系,分别通过western blot以及实时荧光定量PCR方法检测细胞中RASSF8的蛋白质以及m RNA表达水平。3.RASSF8对膀胱癌细胞增殖,侵袭,迁移,周期,凋亡,线粒体功能,氧化应激,葡萄糖代谢的影响:在膀胱癌细胞系T24中转染空载质粒作为对照组,转染RASSF8质粒作为RASSF8过表达组,在J82中转染无效干扰序列作为对照组,转染RASSF8 si RNA作为RASSF8表达缺失组,并通过western blot以及实时荧光定量PCR方法验证转染效率。将新构建的T24-control,T24-RASSF8,J82-control,J82-RASSF8 si RNA细胞分别通过CCK8实验,集落形成实验,Transwell invasion实验,划痕实验,PI单染实验,Annexin V/PI双染实验,JC-1染色实验,ROS实验,2-NBDG染色实验,GOD染色实验,ATP实验验证膀胱细胞增殖,侵袭,迁移,细胞周期,细胞凋亡,线粒体膜电位,氧化应激,葡萄糖摄取量,葡萄糖消耗量,ATP生成量等各类生物学行为的变化。4.RASSF8影响膀胱癌生物学行为的分子生物学机制研究:将新构建的T24-control,T24-RASSF8细胞提取样本总RNA,进行高通量测序,并将m RNA表达数据进行GSEA富集分析,探讨RASSF8表达差异对膀胱癌细胞中生物学过程以及信号通路的影响。新构建的T24-control,T24-RASSF8,J82-control,J82-RASSF8si RNA细胞,收集样本总蛋白,通过western blot方法分析增殖,周期,凋亡等相关蛋白以及肿瘤相关信号通路蛋白表达水平及磷酸化水平变化。膀胱癌细胞中蛋白质之间相互结合作用通过Co-IP实验来验证。结果:1.生物信息学分析结果:TCGA数据库RASSF8 m RNA表达数据统计分析结果显示膀胱癌组织中RASSF8表达量较健康组织明显下调（p<0.001）。19组配对样本中RASSF8在膀胱癌组织中显著下调（p=0.0024）。2.RASSF8在膀胱癌组织和细胞中的表达:免疫组织化学结果显示RASSFF8在膀胱上皮组织中为高表达,而在膀胱癌组织中为低表达或者不表达。膀胱癌组织中RASSF8的低水平表达与肿瘤组织中较高的TNM分期以及肿瘤分级显著相关。Western blot结果显示7例（7/11）膀胱癌组织RASSF8表达下调。3.RASSF8抑制膀胱癌细胞增殖,侵袭,迁移,周期转化,降低细胞线粒体膜电位,抑制葡萄糖代谢,诱导细胞发生凋亡,增强化疗敏感性:增殖实验结果显示RASSF8过表达后膀胱癌细胞的增殖率降低,集落形成数目减少;相反RASSF8表达缺失细胞的增殖率升高,集落数目增加。Transwell invasion实验结果显示,RASSF8过表达后具有侵袭能力的膀胱癌细胞数目减少;相反RASSF8表达缺失后具有侵袭能力的肿瘤细胞数目增加。划痕实验结果显示RASSF8过表达后细胞的迁移距离缩短;RASSF8表达缺失导致细胞的迁移距离增加。PI单染实验结果显示,RASSF8过表达后,G1期所占比例增加,S期所占比例减少;相反,RASSF8表达缺失导致细胞G1期所占比例减少,S期所占比例增加。Annexin V/PI双染实验结果显示RASSF8过表达,细胞的凋亡水平增加,且可进一步增加顺铂诱导的凋亡水平。相反,RASSF8表达缺失,细胞的凋亡水平降低,并可部分逆转顺铂诱导的凋亡。JC-1染色实验结果显示RASSF8过表达后,线粒体膜电位降低,RASSF8表达缺失后线粒体膜电位升高。ROS实验结果显示RASSF8过表达后细胞中ROS含量增加,氧化应激反应增强;相反RASSF8表达缺失ROS含量减少,氧化应激反应减弱。葡萄糖代谢相关实验结果显示RASSF8过表达细胞对葡萄糖的摄取,消耗量减少,ATP生成量减少;相反,RASSF8表达缺失细胞的葡萄糖摄取量,消耗量,ATP的生成量均增加。4.RASSF8调控膀胱癌细胞中YAP信号通路及cyclin D1,Bcl-2,caspase 3的表达,RASSF8抑制膀胱癌细胞中YAP/TEAD3的结合:GSEA富集分析结果显示,RASSF8高表达的膀胱癌表型中富集到了恶性肿瘤进展相关通路,细胞凋亡,DNA修复,有丝分裂,氧化磷酸化,活性氧途径,细胞的化学应激反应,新陈代谢等生物学过程。Western blot实验结果显示RASSF8过表达后,cyclin D1,Bcl-2,caspase3,YAP的表达量降低,cleaved-caspase 3,p-Lats1/2,p-YAP的表达量增加。相反,RASSF8表达缺失后,cyclin D1,Bcl-2,caspase 3,YAP的表达量增加,cleaved-caspase3,p-Lats1/2,p-YAP的表达量降低。Co-IP实验结果显示膀胱癌细胞中,RASSF8过表达可抑制YAP与TEAD3之间的相互结合。联合顺铂耐药实验结果显示,RASSF8通过抑制YAP-TEAD3的结合,进而增加膀胱癌细胞的顺铂敏感性。结论:1.RASSF8在膀胱癌中表达下调。2.RASSF8过表达抑制膀胱癌细胞增殖,侵袭,迁移,周期转化,诱导氧化应激及凋亡,增强顺铂化疗敏感性。3.RASSF8过表达加速了膀胱癌细胞中线粒体膜电位的损失,抑制葡萄糖代谢过程。4.RASSF8调控膀胱癌细胞中周期,凋亡相关蛋白的表达水平,并通过YAP-TEAD3通路增强细胞的顺铂敏感性。