论文部分内容阅读
目的:观察6,8-二-三氟甲基-7-乙酰氧基白杨素(6,8-ditrifluoromethyl-7- acetoxychrysin,dFMAChR)诱导体外培养人肺癌(A549)细胞系细胞生长抑制和凋亡作用;评价dFMAChR体内抗人肺癌作用;探讨dFMAChR活化PPARγ,上调PTEN,抑制Akt磷酸化,激活Caspase-3诱导人肺癌细胞凋亡的作用机制;为寻找具有开发前景的人肺癌治疗的活性新化学实体提供实验和理论依据。方法:体外培养A549细胞,MTT比色法测定dFMAChR对A549细胞增殖活性的影响;平皿克隆形成法和软琼脂克隆形成法测定dFMAChR抑制体外培养A549细胞的锚定依赖性生长和锚定非依赖性生长作用;DNA凝胶电泳确证dFMAChR诱导A549细胞凋亡作用;Hochest染色法荧光显微镜观察dFMAChR诱导A549细胞凋亡的形态学改变; PI染色流式细胞术(FCM)定量分析dFMAChR诱导A549细胞凋亡程度;用人肺癌裸鼠移植瘤模型治疗实验观察dFMAChR体内抗肺癌作用。免疫组化S-P法检测移植瘤组织中VEGF的表达, Western Blot检测dFMAChR对人肺癌细胞PTEN-AKT途径凋亡相关蛋白PPARγ、PTEN、p-Akt、Caspase-3表达及活性的影响。结果:MTT比色法测定结果显示:dFMAChR( 0.3,1.0,3.0,10.0,30.0μM)分别处理48小时,人肺癌A549细胞增殖相对抑制率分别为11.26%, 18.60%, 39.46%, 48.11%, 69.99%其IC50值为8.51μM。dFMAChR(30.0μM)的细胞增殖相对抑制率(69.99%)较同浓度的先导化合物白杨素(Chrysin,ChR)的增殖相对抑制率(53.85%)高。平皿克隆形成法结果显示, dFMAChR(3.0、10.0、30.0μM)分别处理48小时,人肺癌A549细胞的集落抑制率分别为25.0%,50.0%,75.6%,IC50值为9.09μM。dFMAChR(30.0μM)的细胞集落抑制率(75.6%)较同浓度的先导化合物白杨素(Chrysin,ChR)的细胞集落抑制率(17.3%)高。软琼脂克隆形成法结果显示,3.0、10.0、30.0μM的dFMAChR分别处理48小时,人肺癌A549细胞的集落抑制率分别为43.67%,58.50%,84.03%,IC50值为3.75μM。dFMAChR(30.0μM)的细胞集落抑制率(84.03%)较同浓度的先导化合物白杨素(Chrysin,ChR)的细胞集落抑制率(26.67%)高。;10.0、30.0μM dFMAChR处理A549细胞48h,DNA琼脂糖凝胶电泳出现特征性“梯形”DNA条带。Hochest染色荧光显微镜观察不同浓度dFMAChR组(3.0、10.0、30.0μM)处理后,部分A549细胞呈现典型凋亡细胞形态特征,表现为核浓缩,且浓缩核数目随浓度的增加而增加,较ChR(30.0μM)诱导A549细胞凋亡程度更明显。PI染色FCM分析发现dFMAChR( 3.0μM,10.0μM,30.0μM)诱导A549凋亡率分别为12.01%,33.9%,43.5%; ChR凋亡凋亡分别为5.80%,8.4%,25.3%,dFMAChR在低浓度3.0μM时的凋亡率12.01%高于阳性对照药顺铂(DDP)2μg/ml的凋亡率8.3%,接近于紫杉醇(TXA)5μg/ml的凋亡率12.5%。人肺癌裸鼠移植瘤模型治疗实验结果显示:dFMAChR对人肺癌移植瘤生长具有显著抑制作用,10.0、20.0、40.0mg/kg的dFMAChR对移植瘤的瘤重抑制率分别为56.7%,76.1%和82.8%。免疫组化检测结果证实: dFMAChR具有抑制人肺癌裸鼠移植瘤细胞VEGF蛋白表达作用。Western blotting分析结果显示:0.3,3.0,30.0μM的dFMAChR处理A549细胞24小时,A549细胞PPARγ、PTEN、Caspase-3蛋白表达分别上调11.2%,28.6%,43.5%、15.4%,27.3%,35.6%、12.8%,26.9%,42.5%;p-Akt蛋白表达分别下调6.8%,27.9%,44.1%。10.0μM的dFMAChR处理6,12, 24小时,A549细胞PPARγ、PTEN、Caspase3蛋白表达分别上调6.3%,29.5%,46.7%、35.3%,43.1%,57.5%、25.3%,38.8%,56.5%、p-Akt蛋白表达分别下调34.9%,47.2%,55.1%。结论: 1) dFMAChR具有抑制体外培养人肺癌(A549)细胞系细胞增殖和生长作用,呈浓度依赖性。2) dFMACh有效诱导人肺癌细胞A549细胞凋亡。3) dFMAChR显著抑制裸鼠人肺腺癌异种移植瘤的生长,呈剂量依赖性。4) dFMAChR诱导人肺癌细胞生长抑制和凋亡作用与上调PPARγ、PTEN蛋白表达,抑制p-Akt蛋白表达,活化Caspase-3相关。