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D-甘露糖是一种己醛醣,具有抗炎症、预防尿路感染、促进肠道益生菌生长等生理作用,同时在许多药物及功能物质的合成过程中也发挥着重要作用。用生物法实现甘露糖的生产是目前研究的热点。D-来苏糖异构酶不仅能催化来苏糖与木酮糖之间的异构化,也能实现果糖与甘露糖之间的转化。本课题实验主要研究了来源于深海耐热微生物Thermosedminibacter oceani的D-来苏糖异构酶,对重组酶的酶学性质及甘露糖生产进行了研究,并尝试构建共表达体系以更为经济的葡萄糖为原料研究共表达体系性质及甘露糖生产。来源于T.oceani的D-来苏糖异构酶蛋白结构中含有181个氨基酸残基,在GenBank上的登录号为ADL08607.1,编码该蛋白的基因片段全长546 bp。以pET-22b(+)为载体构建重组质粒,用IPTG诱导来苏糖异构酶在大肠杆菌BL21中的过量表达,通过镍柱亲和层析对目的酶进行纯化。SDS-PAGE电泳图显示蛋白相对分子质量为22 kDa,与计算分子量结果一致,凝胶色谱结果显示酶相对分子质量为44 kDa左右,推测该酶为二聚体结构。酶学性质测定结果显示来苏糖异构酶最适温度为65oC,最适pH为6.5,最适金属离子为Mn2+,具有非常显著的温度稳定性。以果糖为底物测得其比酶活为5.3±0.1U/mg,Km值、kcat值与kcat/Km值分别为27.3±1.3 mM、1,030±26 min-1、38±1mM-1min-1。在最适条件下以100g/L的果糖为底物,加酶量为4 U/mL,反应2h后甘露糖的生成率为26.8%。Acidothermus cellulolyticus 11B葡萄糖异构酶蛋白结构中含有407个氨基酸残基,在GenBank上的登录号为ABK53836.1,编码该蛋白的基因片段全长1224 bp。以pETDuet-1为载体构建含有来苏糖异构酶与葡萄糖异构酶的共表达质粒,用IPTG诱导目的基因在大肠杆菌BL21中的过量表达。SDS-PAGE电泳图显示两种酶蛋白分子量分别为22 kDa、42 kDa,与计算分子量结果一致。酶学性质测定结果显示共表达体系最适温度为65oC,最适pH为6.5,最适金属离子为Co2+。在最适条件下以100g/L的葡萄糖为底物,菌体浓度为100g/L时,反应2h后甘露糖的生成率为16.4%。