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糖尿病(diabetes Mellitus, DM)及其并发症严重危害人们健康及生活质量。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是DM最严重的并发症之一,也是糖尿病患者重要的死亡原因。DN早期表现为肾小球内高血压、高灌注、高滤过,进而出现肾小球毛细血管袢基底膜(glomerular basement membrane, GBM)增厚和系膜基质(extracellular matrix, ECM)增多,最终导致肾小球硬化。“三黄泻心汤”亦称“泻心汤”,出自《金匮要略》,由黄连、大黄、黄芩三味中药组成,具有泻火解毒、清热燥湿、除痞止血之功效,是中医临床治疗胃火邪内炽证的常用方剂。泻心汤具有多种药理作用,现代临床应用于急性胃肠炎、肝炎、胆囊炎、口腔炎、痢疾以及外科疮疡。近年有研究表明泻心汤对多种糖尿病模型动物具有降血糖作用,本课题组前期研究显示,泻心汤整方在糖尿病大鼠模型上除可以降低血糖、血脂外,还可以明显改善DN所引起的蛋白尿及肾脏组织学病变。但泻心汤抗DN的物质基础及机制尚不清楚。本研究旨在考察泻心汤抗DN作用的有效成分,特别是考察和证实其是否具有独立于降血糖、调血脂的直接肾保护作用,并进一步揭示泻心汤有效成分之间的配伍关系,阐明泻心汤直接抗DN的可能作用机制,为泻心汤临床应用于DN治疗和进一步优化配方提供依据。第一部分泻心汤及其有效组分对DN模型的作用目的：研究泻心汤及其有效组分对糖尿病大鼠和高糖诱导的体外系膜细胞模型的作用。方法：1、整体实验：采用高脂饮食加低剂量链脲佐菌素方法诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型,随机分为模型组、泻心汤组分组、盐酸二甲双胍(Metformin)组,并设正常对照组,连续用药12周,取血、尿、肾标本,检测各组空腹血糖(FBG)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)和尿微量白蛋白及肾脏超微结构。2、体外实验：体外高糖培养大鼠系膜细胞,药物处理组同时加入不同浓度的泻心汤水提物(Xiexin decoction,生药浓度160ug/ml,400ug/ml,1 mg/ml),黄芩总黄酮提取物(Flavonoids of Radix Scutellariae,8ug/ml,20ug/ml,50ug/ml),黄连总生物碱(Alkaloids of Rhizoma Coptidi,2ug/ml,5ug.ml,12.5ug/ml),大黄非蒽醌提取物(Rhurb extract with 35.7%Polysaccharides of Radix et Rhizoma Rhei, 2ug/ml,l0ug/ml,50ug/ml),孵育24h后采用MTT法测定系膜细胞活力。结果：(1)整体实验：与模型组大鼠相比较,泻心汤组分组用药12周大鼠的BUN下降1.87mmol/L(p<0.05),尿微量白蛋白下降0.54mg/24h(p<0.01),肌酐清除率(CCr)下降3.92ml/min/kg(p<0.01)■电镜结果显示泻心汤组分能显著改善肾小球基底膜增厚、系膜增生及足突融合变化。(2)离体实验：泻心汤水提物(生药浓度) 160ug/ml,400ug/ml,1 mg/ml组的细胞活力与模型组相比分别下降14.84%,51.30%,95.54%；黄芩总黄酮提取物8ug/ml,20ug/ml,50ug/ml组与模型组相比分别下降21%,28%,70%；黄连总生物碱2ug/ml,5ug.ml,12.5ug/ml组与模型组相比分别下降4%,29%,38%：大黄非蒽醌提取物2ug/ml,10ug/ml,50ug/ml组与模型组相比分别下降44%,56%,63%。结论：泻心汤组分具有抗实验性糖尿病大鼠肾病的作用,泻心汤水提物、黄芩总黄酮提取物、黄连总生物碱及大黄非蒽醌提取物均能抑制离体DN模型的细胞增殖,证实泻心汤全方的抗DN作用主要来自于这三个有效组分。第二部分泻心汤有效成分(单体)对DN离体模型的作用目的：研究泻心汤的有效成分小檗碱、黄芩苷和大黄多糖提取物对高糖诱导的离体系膜细胞模型的作用并初步探索机制。方法：体外高糖培养肾小球系膜细胞,药物处理组同时加入不同浓度的小檗碱、黄芩苷和大黄多糖提取物,孵育24h后收集细胞上清,采用MTT法测定细胞相对活力,Elisa法测定Ⅵ型胶原及单核细胞趋化因子(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的浓度,硫代巴比妥酸法检测脂质过氧化产物(Malonaldehyde, MDA)的含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力。结果：(1)与高糖模型组相比,小檗碱(berberine) lug/ml,5ug/ml组的细胞活力分别下降12%,40%(p<0.05)；黄芩苷(baicalin) 2ug/ml,10ug/ml组的细胞活力分别下降21%,48%(p<0.05 or 0.01)。大黄多糖提取物抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖的EC50为3.48ug/m3(2)与高糖模型组相比,小檗碱lug/ml,5ug/ml组的Ⅳ胶原分别下降了2.54ug/ml,5.17ug/ml (p<0.05 or 0.01);黄芩营2ug/ml,10ug/ml组的Ⅳ胶原分别下降了3.06ug/ml,6.37ug/ml (p<0.05 or 0.01);大黄多糖提取物lug/ml,5ug/ml组的Ⅳ胶原分别下降2.22ug/ml,4.96ug/ml (p<0.05 or 0.01)。(3)与高糖模型组相比,小檗碱1 ug/ml,5ug/ml,10ug/ml组的MCP-1水平分别下降113.18ng/ml,164.95ng/ml,197.36ng/ml (p<0.05 or 0.01);黄芩苷2ug/ml,10ug/ml组的MCP-1水平分别下降94.93ng/ml,153.15ng/ml (p<0.05 or 0.01);大黄多糖提取物1 ug/ml,5ug/ml,1 Oug/’m组的MCP-1水平分别下降81.80ng/ml,130.46ng/ ml,160.98ng/ml (p<0.05 or 0.01)。(4)与高糖模型组相比,小檗碱1 ug/ml,5ug/ml,1 Oug/ml组的SOD酶活力分别升高1.93U/ml,5.71U/ml,7.09U/ml (p<0.05 or 0.01);黄芩苷2ug/ml,l Oug/ml组的SOD酶活力分别升高3.47U/ml,7.92U/ml (p<0.05 or 0.01);大黄多糖提取物1 ug/ml,5ug/ml,1 Oug/ml组的SOD酶活力分别升高2.12U/ml,5.57U/ml,8.42U/ml(p<0.05 or 0.01)。(5)与高糖模型组相比,小檗碱1 ug/ml,5ug/ml,1 Oug/ml组的MDA水平分别下降0.51nmol/ml,2.02nmol/ml,7.09nmol/ml(p<0.05 or 0.01);黄芩苷2ug/ml,l Oug/ml组的MDA水平分别下降1.44nmol/ml,4.08nmol/ml,4.26nmol/ml (p<0.05 or 0.01);大黄多糖提取物ug/ml,5ug/ml,1 Oug/ml组的MDA水平分别下降0.433nmol/ml,2.02nmol/ml,3.68nmol/ml (p<0.05 or 0.01)t结论：泻心汤的三个有效成分小檗碱、黄芩苷和大黄多糖提取物均可剂量依赖地抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞的增殖、Ⅳ胶原及MCP-1分泌的增加,证实小檗碱、黄芩苷和大黄多糖提取物是泻心汤抗糖尿病的物质基础。这三个有效成分可能通过抑制氧化应激发挥独立于降糖调脂作用的直接肾小球系膜细胞保护作用。第三部分正交设计研究泻心汤有效成分配伍的抗DN作用目的：研究泻心汤有效成分配伍组合对高糖诱导的肾小球系膜细胞模型的作用。方法：小檗碱(lug/ml)、大黄多糖(lug/ml)和黄芩苷(2ug/ml)三个有效成分采用3因素2水平的正交设计,按L8(27)正交表要求分组,作用于高糖诱导的系膜细胞24h后收集细胞上清,采用MTT法测定细胞相对活力,Elisa法测定Ⅵ型胶原及MCP-1的浓度,硫代巴比妥酸法检测MDA的含量,黄嘌呤氧化酶法检测SOD活力。结果：(1)与模型组相比,联合应用小檗碱和黄芩苷组的肾小球系膜细胞活力与模型组相比下降50.26%(p<0.01),联用小檗碱和大黄多糖提取物组下降35.22%(p<0.01),联用黄芩苷和大黄多糖提取物组下降44.65%(p<0.01),三成分联用组下降达63.73%(p<0.01)。正交分析显示任两成分间均有相加作用。(2)与模型组相比,联合应用小檗碱和黄芩苷组肾小球系膜细胞的Ⅳ胶原水平下降5.48ug/ml(p<0.01),联用小檗碱和大黄多糖提取物组下降5.1 lug/ml(p<0.01),联用黄芩苷和大黄多糖提取物组下降4.53ug/ml (p<0.01),三成分联用组系膜细胞的Ⅳ型胶原水平较模型组相比下降6.94ug/ml (p<0.01)正交分析显示任两成分间均有相加作用。(3)与模型组相比,联合应用小檗碱和黄芩苷组肾小球系膜细胞的MCP-1水平下降157.68ng/ml联用小檗碱和大黄多糖提取物组下降141.83ng/ml(p<0.01),联用黄芩苷和大黄多糖提取物组下降121.05ng/ml三成分联用组下降178.27ng/ml正交分析显示任两成分间均有协同作用。(4)与模型组相比,联合应用小檗碱和黄芩苷组肾小球系膜细胞的SOD活力上升5.51U/ml(p<0.01),联用小檗碱和大黄多糖提取物组上升5.55U/ml (p<0l),联用黄芩苷和大黄多糖提取物组上升6.56U/ml (p<0.01),三成分联用组SOD活力升高8U/ml (p<0.01)。正交分析显示两成分间均有相加作用。(5)与模型组相比,联合应用小檗碱和黄芩苷组肾小球系膜细胞的MDA水平下降2.92nmol/ml联用小檗碱和大黄多糖提取物组下降1.77nmol/ml(p<0.01),联用黄芩苷和大黄多糖提取物组下降2.45nmol/ml三成分联用组下降4nmol/ml(p<0.01)。正交分析显示任两成分间均有相加作用。结论：泻心汤的三个有效成分小檗碱、黄芩苷及大黄多糖提取物在离体DN模型上对抑制肾小球系膜细胞增殖、Ⅳ型胶原表达分泌及氧化应激有相加作用,对MCP-1上调的抑制有协同作用。三个有效成分的相互作用可能是泻心汤作为中药复方抗糖尿病肾病的优势所在,为泻心汤临床应用于DN治疗和进一步优化配方提供依据。