【摘 要】
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牛乳蛋白中的乳清蛋白是婴幼儿食物的重要来源,但是牛乳中的乳清蛋白却容易引起过敏反应,严重威胁身体健康。针对这一问题,本课题进行了下列研究:在基于生物酶法水解乳清蛋白的基础上,分别采用预处理乳清蛋白和后处理乳清蛋白水解产物的方法,降低了乳清蛋白水解物的抗原性,并通过产物的分级分离和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的方法对抗原性下降的机制做出了分析和探讨。主要研究过程和结果如下:（1）筛选了适合
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（编号2017YFD0400600）；
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牛乳蛋白中的乳清蛋白是婴幼儿食物的重要来源,但是牛乳中的乳清蛋白却容易引起过敏反应,严重威胁身体健康。针对这一问题,本课题进行了下列研究:在基于生物酶法水解乳清蛋白的基础上,分别采用预处理乳清蛋白和后处理乳清蛋白水解产物的方法,降低了乳清蛋白水解物的抗原性,并通过产物的分级分离和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的方法对抗原性下降的机制做出了分析和探讨。主要研究过程和结果如下:（1）筛选了适合水解乳清蛋白的酶,并利用超声-离子液体预处理方式降低乳清蛋白的抗原性。首先选取了木瓜蛋白酶、两种胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶为筛选对象,以测定其水解产物的水解度,并根据SDS-PAGE电泳图谱得到产物的组分分布情况,选择出了水解乳清蛋白能力较好的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶各一种。利用超声-离子液体对乳清蛋白溶液进行预处理后,再用所筛选出的蛋白酶对混合溶液进行水解,水解后离心分离回收离子液体,再测定水解产物的抗原性下降率,并且同时关注其水解度和分子量分布情况。经超声-离子液体处理后两种水解产物的β-LG和α-LA的抗原下降率对比直接水解组均有显著提高,碱性蛋白酶组的两种抗原性下降率分别达到了83.16%和77.73%,木瓜蛋白酶组达到了83.24%和76.48%。（2）利用酶解后谷氨酰胺转氨酶再交联的方法降低乳清蛋白的抗原性,并且与超声-离子液体预处理的方式进行比较。先利用嗜热菌蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶,6种酶对乳清蛋白先进行部分水解,再利用谷氨酰胺转氨酶对水解产物进行第二步的催化交联作用,从而达到断裂、掩盖抗原表位来降低抗原性的目的。并结合其产物的性状及分子量分布,对该后处理方式的效果做出评价。蛋白酶-TG酶两步法基本上可以明显提高乳清蛋白中β-LG和α-LA的抗原性下降率。胰蛋白酶-TG酶组的β-LG和α-LA抗原性下降率均最高,分别为89.37%和70.97%,木瓜蛋白酶-TG酶组中小分子量肽含量最高,β-LG和α-LA抗原性下降率分别为82.26%和76.36%。（3）蛋白酶与谷氨酰胺转氨酶联用法降低乳清蛋白抗原性机制探讨。利用超滤方法对效果更优的谷氨酰胺转氨酶再交联方式得到的水解产物按照分子量级进行分离,得到其抗原性与分子量大小的关系。将抗原性最低的部分产物进行AKTA蛋白质纯化分离,按照分子量大小分别测定分离产物抗原性,用LC-MS/MS法检测水解产物中存在的肽段,并得到详细的氨基酸序列,再与已经报道的乳清蛋白中主要的过敏原蛋白的抗原表位进行比较,分析水解处理后抗原表位的变化情况,探讨酶解产物抗原性下降机制。在分子量低于3k Da时,抗原性和分子量大小可能不再存在线性相关性,酶解可以较大程度地破坏致敏蛋白质的抗原表位,使其抗原性降低。
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