【摘 要】
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目的:构建及鉴定p16基因真核表达质粒pcDNA3-HA-p16,探讨外源性p16基因对骨肉瘤细胞系U-2OS的抑制效应。方法:1. RT-PCR扩增p16基因。2.通过分子生物学技术构建p16真核表达质
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目的:构建及鉴定p16基因真核表达质粒pcDNA3-HA-p16,探讨外源性p16基因对骨肉瘤细胞系U-2OS的抑制效应。方法:1. RT-PCR扩增p16基因。2.通过分子生物学技术构建p16真核表达质粒pcDNA3-HA-p16。3.采用脂质体转染的方法将外源性p16基因导入U-2OS细胞。4.通过免疫荧光、Western blot验证pcDNA3-HA-p16在U-2OS细胞中的表达。5.采用CCK-8法检测细胞增殖。6.应用PI单染法分析细胞周期分布。7. DNA ladder法结合PI单染法观察细胞凋亡。结果:1.经重组质粒的酶切鉴定与DNA测序鉴定,成功构建了p16基因真核表达质粒pcDNA3-HA-p16。2.重组质粒通过脂质体转染的方法在骨肉瘤细胞系U-2OS中稳定表达,p16主要分布于细胞核。3. p16显著抑制U-2OS细胞的增殖(P<0.05),而且该作用在一定范围内呈现明显的剂量效应关系。4. p16致使U-2OS G1期细胞比例显著升高(P <0.05),而S期细胞比例显著降低(P <0.05)。5. p16导致U-2OS细胞凋亡率上升明显(P <0.05),DNA经琼脂糖凝胶电泳后呈现典型的DNA ladder。结论:1.成功构建了p16的高效真核表达质粒pcDNA3-HA-p16,且通过脂质体转染的方式其能在骨肉瘤细胞系U-2OS中稳定表达。2.抑癌基因p16显著抑制U-2OS细胞增殖,且该作用在一定范围内呈现明显的剂量效应关系;p16导致U-2OS细胞阻滞于G1期;并显著促进细胞凋亡。因此p16具有显著抑制U-2OS细胞的效应。
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