论文部分内容阅读
鸭疫里默氏杆菌感染(Riemerella anatipestifer Infection)是当前危害养鸭业最为严重的传染病之一，因病鸭死亡率高造成巨大的经济损失。鸭疫里默氏杆菌是黄杆菌科里默氏杆菌属的代表种。已经确定的鸭疫里默氏杆菌血清型有21个，各血清型之间的交叉保护力很低，给疫苗预防本病带来困难。另外，目前对于鸭疫里默氏杆菌的分子致病机制还知之甚少。为了研究鸭疫里默氏杆菌分子致病机制、免疫原性保护蛋白和研制新的血清学诊断方法，本文采用免疫蛋白质组学的方法鉴定了鸭疫里默氏杆菌的一些免疫原性蛋白。另外，构建了载铁体相互作用蛋白的基因缺失株，初步研究了该基因与致病性的关系及其在铁摄取中的作用。一.鸭疫里默氏杆菌免疫蛋白组学研究本研究采用免疫蛋白质组学方法首次对鸭疫里默氏杆菌的免疫原性蛋白进行了研究，利用鸭疫里默氏杆菌Th4株全菌蛋白经2-DE后与鸭疫里默氏杆菌CH3株(血清1型)、Th4株(血清2型)、HXb2株(血清10型)高免鸭血清、模拟自然感染的Yb2株(血清2型)康复鸭血清以及na ve鸭血清免疫印迹反应，然后通过质谱对免疫原性蛋白进行鉴定和分析。结果表明，使用Th4鸭抗血清得到64个免疫原性蛋白质点，通过MALDI-TOF-MS和PMF分析共鉴定到34种蛋白质，包括已经报道的OmpA和GroEL。外膜蛋白TonB-dependent outer membrane receptor与1、2、10型鸭抗血清都能反应，是一种交叉免疫原性蛋白质。这些新发现的免疫原性蛋白质为下一步研究鸭疫里默氏杆菌的分子致病机制、研制新型针对不同血清型鸭疫里默氏杆菌的疫苗和建立新的敏感性高、特异性强的血清学诊断方法等奠定了基础。二.鸭疫里默氏杆菌载铁体相互作用蛋白(SIP)基因缺失株的构建本研究采用自杀质粒同源重组的方法来构建鸭疫里默氏杆菌CH3株的sip基因缺失株CH3△sip。根据鸭疫里默氏杆菌CH3株sip基因上下游的侧翼序列设计引物扩增DNA片段作为同源重组的上下游同源臂，上下游同源臂之间插入壮观霉素抗性基因，来构建重组自杀性质粒。这样以壮观霉素抗性基因来替换sip基因的ORF并以此抗性用于缺失突变株的筛选。重组自杀质粒通过接合转导导入CH3株，经壮观霉素抗性筛选获得sip基因缺失株CH3△sip。在生物学特性上，CH3△sip基因缺失株对雏鸭的致病性比野生株CH3低27倍，且其生长也比野生株CH3慢(p>0.05)。当TSB培养基中含有100μM DIP时，缺失株CH3△sip的生长比野生株CH3显著性降低(p<0.05)，而回复株cCH3△sip的生长与野生株相近似(p>0.05)。以上结果表明SIP是一种毒力相关蛋白，且在CH3株铁的摄取过程中起着重要的作用。这为下一步研究鸭疫里默氏杆菌的运铁系统及其在细菌致病中的作用奠定了基础。