论文部分内容阅读
目的:本实验拟采用物理-生物-化学联合的方式,研究于纯钛表面制备HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层的方法,使钛经表面改性后能具有有利于骨结合的理化形貌以及生化修饰,使之获得相应的生物功能。探讨HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层对大鼠成骨细胞早期粘附与增殖的作用,评价其细胞毒性及其对钛表面成骨细胞特征基因表达的影响,以此为利用表面改性来提高口腔种植体的生物功能和早期骨结合提供理论依据和实验基础,为促进HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层种植体的临床运用进行一定的实验探索。方法:通过物理-化学-生物改性联合的方式来制备HA/CS-TGF-β1缓释微球涂复合涂层。将l0mm*10mm*1mm钛片打磨清洗并进行表面微弧氧化处理后放入多巴胺溶液浸泡18h,干燥。将已溶解的HA缓慢滴入CS凝胶,搅拌溶解1.5h,在经上述步骤处理的干燥钛片表面滴加该溶液,负压处理10min,干燥24h。将经微弧氧化步骤处理的钛片共100片平均分成A、B、C、D、E组,每组20片,为实验组。另备20片只经打磨处理的钛片为对照F组,备5只编号分别为A、B、C、D、E的装有20ml 0.1g/ml CS凝胶的烧杯,各加入0.4g明胶微球,搅拌20min后放入对应的钛片各20片,冰浴下各加入0.08gEDC溶解后加入0.12gNHS,随后立刻加TGF-β1蛋白,加入蛋白浓度分别为A组15ng/ml、B组30ng/ml/、C组60ng/ml/、D组75n/ml、e组250ng/ml。交联反应12h,干燥。以sem、xrd、ft-ir分别检测ha/cs-tgf-β1缓释微球复合涂层的理化结构、生化组成并检测其亲水性,释药量。采用cck-8法,取双抗灭菌后各组钛片各5片平铺于48孔培养板。分离大鼠成骨细胞并进行细胞的原代培养和传代培养,将传代培养后的p2代细胞悬液按100μl/孔的浓度接种于各组,置于37℃、5%c02培养箱中培养;于实验的1、3、7d分别将培养板从培养箱中取出,每孔加cck-8试剂溶液20ul,37℃下孵育2.5h后每孔取110ul液体到96孔板内,使用酶标仪在波长为450nm的条件下检测各孔od值。将成骨细胞按1*103/孔细胞密度接种于各组材料表面,每孔100μl细胞悬液,于6h和3天后分别对细胞核进行dapi染色,将染色后的细胞置于倒置荧光显微镜下观察细胞的增殖情况。将大鼠成骨细胞在复合涂层的钛片上培养1d,2d,3d,5d,7d后取样,对大鼠成骨细胞mrna进行提取,转录,扩增。分别取10μl成骨细胞特征基因alp,runx2,tgf-β1的pcr反应产物,在2.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳得出成骨标志性基因alp,runx2,tgf-β1的条带。结果:成功制备ha/cs-tgf-β1缓释微球复合涂层,扫描电子显微镜(sem)见实验组钛片表面存在形状较为规则的、其大小和间距基本相同的小微孔,载tgf-β1蛋白的明胶微球形状为圆球型,粒径较为均匀,表面可见蛋白吸附。xrd图谱可以看到当钛表面制备ha/cs-tgf-β1缓释微球复合涂层后,基体钛峰几乎被湮没,2θ=31.7o,这与ha标准粉末衍射数据谱峰的(211)晶面的特征峰位置吻和。复合涂层制备完成后接触角几乎为零,即该复合涂层具有超亲水性。ha-cs-tgf-β1体外释药情况:在释药初期ha/cs-tgf-β1复合涂层存在“突释”效应,而后蛋白的释放逐渐平缓,至蛋白释放第7d释放达(58.4±1.8)%,14d时tgf-β1蛋白释放浓度达(80.1±1.9)%。将各组钛片与细胞分别培养1d,3d,7d后,实验结果发现在1d时各组之间的差异不明显(p>0.05),随着对大鼠成骨细胞培养时间的增加,在第3天时,实验组和对照组的大鼠成骨细胞的数量均有较为明显增长且实验组大鼠成骨细胞密度大于对照组的大鼠成骨细胞密度(p<0.05),b、c两实验组的大鼠成骨细胞增殖数目大于其他各组。第7天,实验组细胞增殖情况明显优于对照组(p<0.05),b、c组细胞增殖明显大于其他组(p<0.05),e组大鼠成骨细胞密度小于其他实验组(p<0.05)。大鼠成骨细胞于复合涂层的钛片上生长无抑制,表明该涂层无细胞毒性。大鼠成骨细胞接种于实验组和对照组钛片,孵育6h及3d之后,经dapi对成骨细胞胞核染色后,发现:接种6h,实验组与对照组的钛片表面的大鼠成骨细胞数量并无明显差距;而在3d,各组均有明显增殖,特别是实验b、c组尤其明显,e组的细胞数量少于其他实验组的大鼠成骨细胞数量,所有实验组的细胞数量明显比对照组多,实验结果证实了复合涂层可促进成骨细胞的粘附与早期增殖。在一定tgf-β1浓度下钛表面成骨细胞的alp,runx2基因表达量将随着时间增加,b、c两组尤为明显,而tgf-β1的表达量基本不变。结论:(1)ha/cs-tgf-β1缓释微球复合涂层释药稳定且维持时间长,能较长时间的为组织提供TGF-β1。(2)HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层完成后接触角几乎为零,即具有超亲水性。由细胞的粘附与增殖实验可以看出,亲水性的样品表面确实对相应的细胞的粘附与增殖有促进作用。(3)HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层确实能促进成骨细胞增殖生长,且TGF-β1蛋白释放浓度在一定范围内时,此作用尤为明显。(4)HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层能促进成骨细胞标志性基因的表达,能促进成骨细胞的增殖。