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研究背景与目的乳腺癌已成为威胁我国女性健康最主要的恶性肿瘤,发病率逐年提高,我国乳腺癌的发病率的增幅已经排在世界前列,并且越来越年轻化,针对乳腺癌的治疗手段也随着科技的发展逐渐更替,从上世纪最开始提出的以“局部手术为主”的观念逐渐发展为“全身性治疗”,分子靶向治疗的方式更是当今研究的热门,发现影响着乳腺癌发生发展的基因分子蛋白是非常有必要且有长远意义的。本课题组前期已利用免疫共沉淀法发现RSK4m2蛋白和HSP90aa1蛋白在乳腺癌细胞中具有相互作用。本次研究为了发现核糖体S6蛋白激酶4(RSK4)和热休克蛋白90(HSP90)在乳腺癌是否存在相互作用蛋白的关系,初步探索RSK4蛋白和HSP90蛋白在乳腺癌中的相互调控机制。方法在MDA-MB-231细胞中构建RSK4过表达载体,在MDA-MB-231细胞株中构建RSK4和HSP90的CO-IP蛋白,用免疫共沉淀法在过表达RSK4蛋白的MDA-MB-231细胞株中验证RSK4和HSP90蛋白是否有相互作用;Western blot检测RSK4和HSP90在MDA-MB-231和MCF-7细胞的定量表达,统计学验证差异性和相关性rt-qPCR检测RSK4和HSP90在MDA-MB-231和MCF-7细胞的定量表达,统计学验证差异性和相关性;分别将RSK4蛋白和HSP90蛋白种植在与荧光二抗配对的共聚焦皿上,然后用共聚焦激光显微镜检测RSK4和HSP90在MDA-MB-231和MCF-7细胞的定位表达和荧光定量表达的差异性;收集临床102例乳腺癌患者的癌组织标本和癌旁组织标本及其对应的临床病理信息,免疫组织化学法半定量检测RSK4和HSP90在癌组织和癌旁组织的表达并用统计学方法检测表达的相关性。结果1、免疫共沉淀法检测出RSK4和HSP90蛋白的共沉淀蛋白,说明两者具有相互作用;2、Western bolt的结果显示RSK4在MCF-7蛋白水平的表达比MDA-MB-231高,(t=4.554,P=0.045);HSP90在MDA-MB-231蛋白水平的表达比MCF-7高(t=6.238,P=0.028)。线性回归法示RSK4与HSP90在蛋白水平的表达呈负性相关(r=-0.849,P=0.032)。3、免疫荧光结果示RSK4在MDA-MB-231和MCF-7细胞均在细胞质定位表达,HSP90同样均在细胞质表达,极少数表达在细胞膜和细胞核。激光共聚焦显微镜下观察RSK4在MCF-7细胞的荧光强度高于MDA-MB-231,说明RSK4的蛋白表达量在MCF-7中高于MDA-MB-231细胞株,RSK4蛋白倾向于在低度恶性乳腺癌细胞株中表达;激光共聚焦显微镜下观察HSP90在MCF-7细胞的荧光强度弱于MDA-MB-231,说明HSP90的蛋白表达量在MCF-7中低于MDA-MB-231细胞株,HSP90蛋白倾向于在高度恶性乳腺癌细胞株中表达;4、RT-qPCR的结果示RSK4的mRNA表达量在MDA-MB-231和MCF-7分别为1、1.271±0.042,t test显示RSK4在两种细胞表达有统计学差异,在MDA-MB-231细胞株的表达量低于MCF-7(P=0.001,t=14.41);HSP90的mRNA在MDA-MB-231和MCF-7分别为1、0.744±0.082,t test显示HSP90在这两种细胞的表达有统计学差异,在MDA-MB-231细胞株的表达量高于MCF-7(P=0.002,t=6.931)。线性回归法示RSK4和HSP90在mRNA水平的表达呈负相关性(P<0.05,r=-0.935)。5、免疫组化结果示镜下观察见RSK4蛋白在乳腺癌组织中主要呈中等或弱阳性表达;在癌旁组织中以中等阳性表达为主,极少数呈现强阳性表达。RSK4在34例(33.7%)癌组织、67例癌旁组织(66.5%)呈阳性表达,癌组织阳性表达率低于癌旁组织(c2=21.018,P<0.05);HSP90蛋白在乳腺癌组织中主要呈强阳性或中等阳性表达,在癌旁组织中以中等和弱阳性为主。HSP90在75例(74.5%)癌组织、30例(29.4%)癌旁组织呈阳性表达,癌组织阳性表达率高于癌旁组织(c2=41.218,P<0.05);卡方检验分析出RSK4与临床病理相关因素得出得出RSK4的表达水平与组织学分化(P=0.000)、ER的表达(P=0.038)、PR的表达(P=0.002)和HSP90的表达(P=0.004)有相关性,与肿瘤大小、淋巴结转移情况、HER2表达情况和是否远处转移无相关性(P>0.05)。结论(1)RSK4在人乳腺癌组织中低表达,HSP90高表达;(2)RSK4蛋白和HSP90蛋白在乳腺癌MDA-MB-231细胞株中存在相互作用关系;(3)RSK4和HSP90在乳腺癌细胞株MCF-7、,MDA-MB-231中表达呈负性相关。