研究背景:先天性脊柱侧凸(Congenital scoliosis,CS)是一种由于脊柱畸形而具有不同的临床和解剖学表现的出生缺陷。先天性脊柱侧凸在临床上可单独存在,也可合并其他系统的先天畸形作为综合征的一部分临床表现。先天性脊柱侧凸是患者致残致畸的最主要原因之一,同时也会给患者家庭和社会带来极大负担。先天性脊柱侧凸的发生来源于轴旁中胚层、体节或轴向骨的异常发育。在人类和其他脊椎动物中,椎体周期性地从体节来源并发育形成的过程被称为体节形成(Somitogenesis)。体节形成的过程中有基因,信号通路以及相关效应因子之间复杂的相互作用。在体节发生中任何相关因子的异常都可能导致CS。此外,环境因素也被认为是CS的重要原因。近年来,随着相关研究关于基因突变和效应因子改变的致病机制逐渐被揭示,人们对CS的遗传病因学的关注也越来越多。在研究方法层面,全外显子组测序(Whole exome sequencing,WES)现已广泛应用于临床上寻找先天性畸形的遗传病因。此外,表现为基因组DNA中的缺失或重复变异的拷贝数变异(Copynumber variation,CNV),也可能导致先天性畸形。因此,为了系统地探索CS的遗传病因学应该同时关注单核苷酸变异(Single nucleotide variation,SNV)和CNV水平的变异。此前已有研究报道,中国汉族人群中约10%的CS患者其遗传病因是由于TBX6基因的复合杂合遗传模式导致的。TBX6基因的复合杂合遗传模式是指16p11.2缺失或TBX6基因的无效变异(null variants,TBX6基因的无义突变或移码突变)与另一条链上“T-C-A”亚效等位基因的组合,在此模型下,TBX6基因的剂量降低导致单倍剂量不足(Haploinsufficiency)从而导致CS,基于此复合杂合遗传模式的CS患者被定义为TBX6相关性的先天性脊柱侧凸(TBX6-associated congenital scoliosis,TACS)。然而,TBX6基因的复合杂合遗传模型仅能解释约10%的临床病例,在此模型中,仅针对了 16p11.2缺失或TBX6基因的无效突变进行了致病性及机制研究。在WES数据解读的实际工作中,致病性不明的突变(Variants of unknown significance,VUS)在WES测序数据中约比约为50%,而此前的研究中并没有针对VUS的分析策略或评估其致病性的方法。在本研究中,我们将针对TBX6基因的VUS尝试建立系统的分析和评估策略,以揭示TBX6基因的VUS的致病性及相关机制,从而进一步扩大CS的疾病突变谱并提高临床的诊断率,为CS的研究、诊治、预防提供新的指导。研究目的:研究TBX6VUS的致病机制,包括候选突变筛选,体外功能实验和表型-基因型相关性研究。研究方法:我们对523例中国汉族先天性脊柱侧凸患者进行了全外显子组测序及数据分析,并分析了美国混合临床队列中260例携带TBX6基因突变的患者,从中入组2例携带有TBX6基因的VUS的患者。Sanger测序用于验证突变,单倍型测试用于验证候选对象是否具有T-C-A的亚效等位基因,基于WES数据运用相关软件(XHMM和Conifer)进行CNV分析。体外实验部分包括双荧光素酶报告基因检测系统,蛋白质免疫印迹实验以及免疫荧光实验等以评估致病性。通过“表型-基因型”相关性研究来系统地评估TBX6的VUS和CS之间的关联性。研究结果:在523例中国汉族先天性脊柱侧凸患者,以及美国混合临床队列中,通过外显子测序数据解读、单倍型分析、CNV分析以及体外细胞水平功能实验,我们在11例无关联的CS患者中共鉴定出6个会导致TBX6的基因功能受影响的突变,其中2个来自美国德克萨斯州队列中的2例患者。11例患者中有10例被鉴定出具有TBX6的亚效等位基因。正如之前报道的TACS研究预测,这10例患者临床上共同表现为以半椎体为主、少节段受累的分节障碍等畸形。剩余的1例患者具有TBX6的纯合突变(c.418C>T),且由于TBX6剂量下调更为严重,其临床呈现出更严重的脊柱畸形表型。研究结论:针对TBX6的致病性不明的突变,通过系统评估细胞水平的功能实验结果,以及“表型-基因型”关联分析对TBX6基因与先天性脊柱侧凸间的剂量效应关系进行总结,我们发现TBX6的错义突变(Missense variant)和框内插入突变(In-frame insertion)可以通过引起转录活性降低和细胞定位异常等分子机制导致先天性脊柱侧凸的发生。本研究扩大了先天性脊柱侧凸的TBX6基因突变谱,提高了其分子诊断检测率,为CS的基因剂量模型提供了进一步证据,并对脊柱侧凸进行了基于分子水平精确的临床分类。此外还为候选基因的致病性不明突变的致病性评估提供了系统的,科学的研究方法与策略。