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钩吻素子是钩吻生物碱中含量最高且高效低毒的一种有效成分,具有重大的新药创制前景。药物的代谢研究是新药研发的重要内容,课题组对钩吻素子在人和多种动物体外肝微粒体代谢进行了初步的比较研究和代谢酶亚型分析,本研究进一步开展钩吻素子在不同种属体外肝微粒体代谢的酶动力学参数分析,以预测其在体内代谢的动力学特征;并采用LC-MS/MS法测定血浆样品中的钩吻素子含量,进行恒河猴和SD大鼠的毒代动力学研究,以评价其全身暴露水平,并确定暴露量与给药剂量及给药时间的相互关系,为临床安全性评价提供参考依据。一、钩吻素子的体外肝微粒体酶代谢动力学研究采用优化的反应体系和UPLC检测方法,测定系列浓度钩吻素子（0.15,0.29,0.73,1.83,3.65 mmol·L-1）与各种属肝微粒体孵育的降解曲线,以底物消除法计算各种属酶动力学参数。结果:在人肝微粒体,钩吻素子的Km、Vmax、T1/2、CLint分别为（0.135±0.067）mmol·L-1、（1.89±0.19）μmol·min-1·g-1pro、（712±23）min和（15.7±5.2）mL·min-1·g-1pro。与人相比,犬和猪的Km值较大,分别为（0.673±0.042）和（0.556±0.188）mmol·L-1;大鼠和猴的CLint值较高,分别为（144.1±18.1）和（230.1±95.6）mL·min-1·g-1pro;4种实验动物的Vmax值均较大为（5.69±1.13）19.16±1.14μmol·min-1·g-1pro、T1/2均较短为（120±11）362±38min。二、建立恒河猴和SD大鼠血浆中钩吻素子含量测定的LC-MS/MS方法采用液液萃取法处理血浆样品,以钩吻素甲为内标。HPLC条件:采用Gemini 5μC18色谱柱（110A,50×2.0 mm）,流动相为甲醇-水-氨水（49∶51∶0.00625）,流速为0.2 mL·min-1,柱温为30℃,进样量为5μL。MS条件:采用正离子模式,多反应监测（MRM）模式监测;离子监控通道为m/z 307.2→m/z 180.2（钩吻素子）,m/z 323.2→m/z 236.1（钩吻素甲）;干燥气流速为10 L·min-1;干燥气温度为350℃;喷雾气25 psi;Vcap为3500 V;碰撞诱导解离电压为140 V（钩吻素子）、135 V（钩吻素甲）;碰撞能量为56 V（钩吻素子）、25 V（钩吻素甲）;驻留时间为200 ms。结果:建立的LC-MS/MS测定血浆钩吻素子含量的方法,专属性好,在0.12400 ng·mL-1和0.1160 ng·mL-1范围内线性良好,定量下限为0.1 ng·mL-1,日内和日间精密度良好RSD均小于15%,提取回收率均大于70%,方法回收率、基质效应均在85%115%之间。血浆样品在室温放置6 h、三次冻融循环及待测定样品在进样器中放置24 h均保持稳定。三、恒河猴鼻饲给予钩吻素子的急性毒性试验伴随毒代动力学研究恒河猴鼻饲给药急性毒性试验采用累积剂量法(剂量设置为5、10、20、40、80 mg·kg-1),设阴性对照组和给药组,每组4只动物,雌雄各半。每天给予一个递增剂量,在首剂(5 mg·kg-1)及可能毒性剂量(40 mg·kg-1)下于给药前、给药后定时采血进行伴随毒代动力学研究。540 mg·kg-1均未见明显毒性症状,80 mg·kg-1剂量下见1只雌性动物出现一过性足震颤及一过性头部震颤。血液学、血液生化等临床检验指标及大体解剖均未见明显异常。伴随毒代动力学结果显示:（1）40 mg·kg-1与5 mg·kg-1比较:雌性动物Cmax、AUC0-t分别为8.73和14.99倍,雄性动物分别为10.64和24.24倍,提示体内暴露量的递增倍数高于剂量增加倍数;Tmax呈延迟趋势(5 mg·kg-1剂量下均为60 min,而40 mg·kg-1剂量下3/4的动物均为120 min);在雄性动物中,40 mg·kg-1剂量下T1/2（分别为64.44、69.62 min）较5 mg·kg-1剂量（分别为39.65、44.62 min）有一定延长。（2）性别比较:雌性动物的暴露量较高,5 mg·kg-1剂量时雌性动物的Cmax、AUC0-t分别为雄性动物的2.25、2.57倍;40 mg·kg-1剂量时雌性动物的Cmax、AUC0-t分别为雄性动物的1.84、1.59倍。四、SD大鼠重复灌胃给予钩吻素子的毒代动力学研究SD大鼠重复灌胃给药两周毒代动力学试验设阴性对照组和3个剂量给药组(10、30、90 mg·kg-1),每组6只动物,雌雄各半。于首、末次给药的给药前、给药后定时采血进行毒代动力学研究。各组动物均未见明显异常反应,血液学、血液生化和组织病理学检查等均未见有明显毒理学意义的变化。补充进行的150 mg·kg-1组试验（4只动物,给药7天）可见动物均出现活动低下、震颤等症状并持续5天,其中1只雌性动物首次给药后死亡。毒代动力学结果显示:（1）钩吻素子在SD大鼠的体内暴露量随着给药剂量增加而增高。（2）30和90 mg·kg-1组末次给药后的Cmax及AUC0-t较首次有一定增高,提示可能有一定蓄积。（3）钩吻素子在大鼠体内的暴露量具有明显的性别差异,相同剂量比较,首次给药雌性大鼠的Cmax是雄性的1.667.40倍,末次给药为2.1011.58倍;首次给药雌性大鼠的AUC0-t是雄性的2.6811.42倍,末次给药为4.3913.74倍。以上结果提示:1.钩吻素子在人与不同实验动物种属肝微粒体中的酶反应动力学特征有较明显的差异,与人相比,犬和猪的Km值较大,大鼠和猴的CLint值较高,4种实验动物的Vmax值均较大、T1/2均较短。2.钩吻素子在恒河猴体内的暴露量随给药剂量的增加而增高,且增高倍数高于剂量增加倍数,提示其在高剂量下可能有一定蓄积;雌性恒河猴体内暴露量明显高于雄性恒河猴。3.钩吻素子给药14天,在SD大鼠体内暴露量随给药剂量及给药时间的增加而增高,且较高剂量下可能有一定蓄积。雌性大鼠体内暴露量显著高于雄性大鼠。