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鸡球虫病（Coccidiosis）是由艾美耳属球虫（Eimeria）寄生于鸡肠道内引起的一种严重危害养鸡业的原虫病。鸡球虫发育经历裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖3个阶段,配子生殖形成的卵囊从鸡粪便排出,卵囊在外界环境中进行孢子生殖,形成具有感染性的孢子化卵囊,鸡食入孢子化卵囊后感染,因此,阻碍卵囊形成可阻断病原的传播。在球虫大配子体中,位于成壁体的配子体蛋白是卵囊壁的前体蛋白。基于上述原理和发现,国外学者用分离于巨型艾美耳球虫（E.maxima）配子体的抗原研制了鸡球虫病亚单位疫苗。此外,发现抗巨型艾美耳球虫配子体抗原的单抗可以阻断配子体的受精过程,并用单抗证实成壁体蛋白参与卵囊壁的形成。毒害艾美耳球虫（E.necatrix）是7种鸡球虫中致病性最强的球虫之一,可引起鸡的急性小肠球虫病,导致育成鸡的大批死亡。毒害艾美耳球虫配子体抗原EnGAM22是卵囊壁的前体蛋白,本实验室在前期研究中已对该蛋白基因进行了克隆与原核表达,研究发现用重组蛋白免疫鸡能产生高水平的血清抗体,对毒害艾美耳球虫感染有一定的免疫保护力。但该配子体抗原EnGAM22单克隆抗体对感染了毒害艾美耳球虫的雏鸡是否具有免疫保护效果尚不了解。为此,本文开展了毒害艾美耳球虫配子体抗原EnGAM22单克隆抗体的制备及其保护作用的研究。研究结果可为鸡球虫多肽和新型疫苗分子的设计及诊断试剂的开发奠定基础,也为球虫卵囊壁形成机制研究提供工具。1.毒害艾美耳球虫配子体抗原EnGAM22单克隆抗体制备与鉴定及其定位应用用NI-NTA亲和层析介质纯化重组配子体抗原rEnGAM22,免疫BALB/c小鼠,3次免疫后取脾脏细胞与杂交瘤细胞进行融合,用预先建立的ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行4次亚克隆,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株2F3和3D3,并对单抗亚类和特异性进行鉴定以及应用单抗进行天然蛋白的虫体定位。结果显示,单克隆抗体2F3和3D3亚型分别为IgG2a、IgG2b,纯化后腹水效价分别为1:256000、1:64000,能特异性识别重组抗原rEnGAM22和毒害艾美耳球虫天然配子体蛋白,不能识别异种球虫天然配子体蛋白。免疫荧光定位显示单克隆抗体2F3和3D3能特异性识别大配子体的成壁体和卵囊壁,表明EnGAM22抗原参与成壁体以及卵囊壁的形成。2.单克隆抗体2F3和3D3的抗原表位初步鉴定结合Engam22基因的氨基酸序列分析和抗原表位预测结果,将Engam22基因分为相互重叠的 4 个片段:Engam22-1（20-73aa）、Engam22-2（64-112aa）、Engam22-3（112-151aa）、Engam22-4（142-186aa）,分别构建原核表达载体,转化至宿主菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳以及Western blot鉴定结果显示,重组菌均能正确表达截短的融合蛋白。用2株单抗对截短蛋白分别进行Western blot分析和ELISA试验,确定单抗2F3和3D3均识别的线性表位段是aa142-186。3.单克隆抗体2F3和3D3对雏鸡的被动免疫保护试验以黄羽鸡为试验动物,以病变记分、平均增重、相对增重率、卵囊减少率、卵囊孢子化率等为指标,评价单克隆抗体2F3和3D3对毒害艾美耳球虫的保护效力,并与兔抗EnGAM22多克隆抗体比较。进行2次试验。第一次试验设9组:2F3单抗高剂量（150 μg）、低剂量组（75 μg）,3D3单抗高剂量（150 μg）、低剂量组（75 μg）,兔多抗IgG高剂量（150μg）、低剂量组（75 μg）,正常鼠IgG对照组,未免疫攻虫组（阳性对照组）和未免疫未攻虫组（阴性对照组）;第二次试验设7个组:2F3单抗组（150μg）,兔多抗IgG组（150μg）,2F3单抗与兔多抗联合免疫组（150μg+150μg）,正常鼠IgG组、正常兔IgG对照组,未免疫攻虫组（阳性对照组）和未免疫未攻虫组（阴性对照组）。攻虫后第3d各免疫组按规定剂量经腹腔注射单抗或多抗,每天一次,连续用5 d。攻虫后第7.5 d结束试验。第一次试验结果:成活率均为100%;除3D3单抗低剂量组外,各免疫组的病变记分均显著低于未免疫攻虫组（P<0.05）;免疫组的平均增重1（3D3单抗低剂量组除外）显著高于未免疫攻虫组（P<0.05）,平均增重2（3D3单抗高、低剂量组除外）显著高于未免疫攻虫组（P<0.05）;多抗高剂量组的卵囊减少率最高（58.04%）,其次为2F3高剂量组（53.47%）;2F3高剂量组的卵囊孢子化率最低（42.50%）,未免疫攻虫组为92.50%。第二次试验结果:各试验组成活率均为100%;各免疫组的病变记分均显著低于正常鼠IgG、正常兔IgG和未免疫攻虫组（P<0.05）;免疫组的平均增重1和平均增重2显著大于未免疫攻虫组（P<0.05）;联合免疫组的卵囊减少率最高（59.28%）;联合免疫组的卵囊孢子化率最低（47.00%）,未免疫攻虫组为94.50%。结论:抗EnGAM22单克隆抗体有一定的被动免疫保护力。