[背景与目的]Exosome是由十余种具有3’→5’RNA核酸外切酶活性组分组成的蛋白复合体,是基因转录后调控的重要机制,被誉为“RNA的蛋白酶体”,它可以严密调节目的基因mRNA的稳定性。CML28是核酸外切酶体exosome的核心组分之一,是利用SEREX技术从慢性髓细胞白血病(CML)细胞的cDNA表达文库中筛选出来的肿瘤抗原,相对分子量为28kD,基因全长1126bp,定位于19号染色体长臂1区3带(19q13)。CML28抗原在正常组织除睾丸外基本不表达,而在肿瘤细胞中高表达,在黑色素瘤、肺癌和前列腺癌等实体瘤患者中有10%～33%的患者体内可以检测到高滴度的CML28特异性抗体,从以上特征中可以推测CML28可能是一个新的肿瘤/睾丸抗原。我们的前期研究显示CML28在CML-急变期(BC)高表达,而且可能与CML细胞的增殖调控密切相关。生物信息学初步结果显示CML28与APCcdh1之间可能存在相互作用,这为exosome与APC/C这两个在细胞增殖代谢中扮演重要角色的蛋白复合体之间建立了一座桥梁。泛素-蛋白酶体通路(Ubiquitin-proteasome Path-way,简称UP通路)是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一,该通路调控着动植物体内几乎所有的生命活动,包括细胞增殖、分化、凋亡、DNA复制和修复、转录和蛋白质质量控制等,并参与病原体的入侵、致病和人类机体的免疫应答等过程。它掌控着从生殖、发育、生长到衰老等各种重大生命过程。泛素介导的蛋白质降解通路是蛋白质功能的主要调节者和终结者,它由底物蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个过程组成。泛素是一条由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链,因其广泛分布于各类细胞而得名。泛素与其底物蛋白质的赖氨酸残基共价结合的过程称为泛素化。泛素化是一个主要有泛素激活酶E1、泛素载体蛋白E2和泛素连接酶E3等介导的多酶级联反应。泛素可以直接从E2转移至特定的靶蛋白形成泛素-蛋白复合物,而在大多数情况下,靶蛋白先与E3特异性结合,E3可使E2和靶蛋白相互接近,继而靶蛋白与E2所连接的泛素结合,这样就完成了靶蛋白的泛素化。在此过程中,E3起着极其重要的作用,它决定了底物泛素化的时间性和特异性。在人类基因组中,只有一种编码E1的基因,少于60种编码E2的基因,以及多余400种编码E3的基因,E3使泛素对底物蛋白的选择具有特异性。在大部分泛素化过程中,底物蛋白的选择以及泛素的连接都是通过特异的E3来实现的,所以E3也被认为是泛素化过程中最为关键的酶,而被称为泛素化系统中的“脑”。许多以复合体形式存在的E3逐渐被人们所发现,主要有APC/C和SCF复合物两大类,它们对基因转录、细胞周期、信号转导等过程具有重要的调控作用。APC/C多聚E3泛素连接酶有两个作用底物链接蛋白APCcdc20和APCcdh1,二者在细胞周期调控中扮演重要角色。有丝分裂晚期至G1期之间,APCcdh1处于活化状态,参与调控细胞的有丝分裂,特别在细胞周期G1/S期转换过程中起关键作用,作为细胞周期调控蛋白参与调控G1期至S期期间精细的DNA修复功能。而APCcdc20在G1、S、M期起重要作用。精确的DNA复制过程以及染色单体分离过程在细胞分裂及维持基因稳定性中极为关键。有研究报道在滋养层细胞及纤维母细胞中APCcdh1与维持基因稳定性密切相关,相反,APCcdc20的激活与基因畸变之间可能有关联,在成人T淋巴细胞白血病中APCcdc20可被Tax激活,并使细胞有丝分裂出现异常,出现非整倍体的复杂核型,形态上表现为多核细胞或胞核盘绕的细胞。APCcdh1在非小细胞癌、胃间质性肿瘤、乳腺癌及直肠癌等实体肿瘤细胞中均有所表达外,在血液肿瘤,特别是包括慢性髓系白血病细胞中为高表达,显示APCcdh1在包括实体瘤和血液肿瘤的发生发展中发挥重要调控作用。近年来APCcdh1蛋白已成为肿瘤发生发展中的研究热点,如前所述已有多家研究其在实体肿瘤中的作用。但尚无研究证实APCcdh1在慢粒急变病程中对维持基因稳定性的作用以及酩氨酸激酶抑制剂及蛋白酶体抑制剂对APCcdh1-Skp2-p27通路的影响。Skp2是SCF (Skp1/Cull/F-box protein)泛素连接酶复合物的亚基之一,在多种人类肿瘤中表达量上调,所以被认为是一种潜在的癌蛋白,它的过表达与许多肿瘤的发生具有相关性,如乳腺癌、胃癌、肺癌等。SCF/Skp2通过诱导细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p27和p21的降解从而参与调控细胞周期。而不同的E3彼此之间也会存在相互制约的关系,已有研究表明在许多肿瘤中, APCcdh1可以通过调节Skp2-p27通路来影响肿瘤的发生和进展,如胃间质细胞瘤、乳腺癌及结肠肿瘤。本课题研究根据前期研究结果,CML28参与了K562细胞的增殖调控,我们拟：①应用生物信息学的方法寻找与CML28相互作用的蛋白,为进一步探讨CML急变期的作用机制以及相关的信号通路提供一些有益的方向性的提示；②根据生物信息学预测及初步验证结果,检测与CML28相互作用的后期促进复合物底物链接蛋白APCcdh1在K562细胞及CML-BC原代细胞中的表达；③分别应用酪氨酸激酶抑制剂及蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理K562、K562/IM细胞及CML-BC原代细胞,研究处理后APCcdh1-Skp2-p27通路、APCcdh1蛋白的表达及其在细胞内定位的变化情况,以及细胞周期、凋亡的变化,探讨伊马替尼和硼替佐米对CML细胞生物学的影响及其作用机理；④靶向沉默APCcdh1的表达,研究APCcdh1在K562细胞中对APCcdh1-Skp2-p27通路以及对APCcdc20的调控作用。[方法]1、我们借助生物信息学的方法,采用UCSC人类基因组数据库、InterProScan、ProtoNet、Motifscan、ELM及PDB等生物信息学在线软件工具对CML28的性质、功能和结构域进行了预测研究分析,寻找可能与之相互作用的蛋白,并进一步运用CO-IP及免疫荧光的方法对二者之间的相互作用进行验证。2、根据生物信息学预测及初步验证的结果,应用Western-blot方法从蛋白表达的水平检测APCcdhl在对伊马替尼耐药或敏感及伴/不伴有附加染色体核型表达的CML-BC细胞中的表达情况,应用免疫荧光技术从蛋白定位的水平检测APCcdhl和Skp2在CML-BC细胞中的定位情况。3、分别应用伊马替尼或尼罗替尼和硼替佐米处理K562细胞、K562-IM细胞及CML-BC原代细胞,运用Western-blot方法检测APCcdh1-Skp2-p27通路中各蛋白表达水平的变化,采用FACS检测伊马替尼和硼替佐米对K562细胞的凋亡及细胞周期的影响,探讨酪氨酸激酶抑制剂及硼替佐米如何通过影响APCcdh1-Skp2-p27通路来发挥杀伤CML肿瘤细胞效应的。4、根据APCcdh1和Skp2的cDNA全长分别设计和合成靶向针对APCcdh1和Skp2的siRNA靶序列,序列如下：APCcdh1 siRNA:5’-UGAGAAGUCUCCCAGUCAG-3’Skp2 siRNA:5’-GCAUGUACAGGUGGCUGUU-3’运用Western-blot及免疫荧光的方法分别检测APCcdh1和Skp2干扰片段对于K562细胞APCcdh1和Skp2的沉默效率；采用FACS检测沉默APCcdh1后K562细胞的细胞周期变化情况；采用免疫荧光技术观察干扰APCcdh1后K562细胞核形态的变化,并应用Western-blot方法检测干扰APCcdh1后K562细胞中APCcdh1-Skp2-p27通路蛋白及APCcdc20的表达变化。[结果]1、我们借助生物信息学的方法,采用UCSC人类基因组数据库、InterProScan、ProtoNet、Motifscan、ELM及PDB等生物信息学在线软件工具对CML28的性质、功能和结构域进行了预测研究分析,分析结果显示：CML28蛋白存在多个(Motif:126-131/210-215/222-227/257-262)可被APC/C底物链接蛋白APCcdhl/APCdcc20识别及相互作用的高度保守结构域D-box, CML28可能与APCcdh1存在相互作用及相互调控关系。并应用CO-IP及免疫荧光的方法初步验证了APCcdh1与CML28之间可能存在某种相互作用。2、APCcdh1在K562细胞以及CML-BC原代细胞中有不同程度的表达,在K562细胞株中APCcdh1高表达,在对伊马替尼耐药并伴有附加染色体核型改变的CML-BC原代细胞中APCcdh1相对低表达,而在对伊马替尼敏感及不伴有附加染色体核型改变的CML-BC原代细胞中,APCcdh1的表达相对较高。3、伊马替尼或硼替佐米可促进K562细胞的凋亡,并分别使细胞静止在G0/G1期或停滞在G2/M期。二者作用于K562细胞后均可上调APCcdh1的表达,同时下调Skp2并募集p27,应用尼罗替尼或硼替佐米处理K562/IM细胞也可得到相同的结果。同时还发现,伊马替尼及硼替佐米处理后,K562细胞中APCcdh1的分布从胞浆转至胞核。4、应用siRNA瞬时干扰APCcdh1的表达,Western-blot及免疫荧光检测结果显示其表达明显下调。FACS结果显示干扰APCcdh1可加快细胞从G1期向S期的转化,并伴随着细胞核形态花样改变。Western-blot结果还显示,APCcdh1表达下降的同时可明显促进Skp2和APCcdc20的募集、下调p27,从而影响K562细胞增殖动力学。[结论]1.采用多种生物信息学在线软件工具对CML28的性质、功能和结构域进行分析,发现CML28与APCcdh1之间可能存在相互作用。进一步应用免疫共沉淀以及共定位分析的方法,从内源性和外源性两方面初步验证了APCcdh1与CML28之间的相互作用。2.在伊马替尼耐药并伴有附加染色体核型异常的CML患者中APCcdh1的表达较低,而在对伊马替尼敏感同时不伴附加遗传学改变的患者中APCcdh1高表达。3.酪氨酸激酶抑制剂及硼替佐米可以诱导APCcdh1的表达及定位发生变化,通过APCcdh1-Skp2-p27这一独立于bcr-ab1激酶途径以外的通路对CML-BC细胞起到调控作用。4.硼替佐米处理IM耐药的CML-BC细胞可以诱导APCcdh1的表达上调,并诱导细胞凋亡。5.干扰APCcdh1后可上调Skp2的表达,下调p27的表达,而干扰Skp2后可上调p27,说明在K562细胞中存在APCcdh1-Skp2-p27通路,并参与影响细胞增殖动力学效应。