土壤杆菌在不同有机酸诱导下的定殖作用及溶镉机制的研究

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本试验前期从广州市郊区菜园土中筛选出一株解钾菌T29,结合其形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定为土壤杆菌属(Agrobacterium sp)。采用摇瓶实验评估了T29对碳酸镉的活化能力,运用代谢组学方法研究了T29在含K+和不含K+的培养基中活化Cd的分子机制,揭示了T29在K+作用下的代谢响应变化。同时,采用高通量测序的方法测定了T29的全基因组,为后期运用基因组学方法研究T29的溶镉机制奠定了基础。然后通过趋化、群游、体外和盆栽实验探讨了不同有机酸或氨基酸对T29的定殖作用及其活化土壤中Cd的影响,从而确定T29的信号分子。研究结果对开发镉污染农田土壤植物-微生物联合修复技术、保障农产品安全具有重要的意义。试验的主要结果如下所示:(1)摇瓶实验中,接菌后培养液中的有效态P和Cd的含量与不接菌相比均有显著提高(p<0.05)。随着发酵培养基中K+含量的增加,T29的溶磷量和溶镉量也在不断提高,在含有100 mg·L-1的K+的培养基中,有效态的P和Cd的含量达到最大值,分别为65.6和43.0 mg·L-1。同时,T29在含有100 mg·L-1 K+的培养基中所分泌的胞外代谢物含量与不含K+相比均有显著差异(p<0.05)。其中3-羟基丁酸、脯氨酸、丁二酸、甘油酸、2-己烯酸、反丁烯二酸、丝氨酸、3,4-二甲基苯甲酸、酒石酸、壬二酸的含量相比不含K+均显著增大(p<0.05),关键的代谢通路如丁酸代谢(Butanoate metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢(Arginine and proline metabolism)、柠檬酸代谢(Citrate cycle)均有明显变化。研究表明,K+会促进T29分泌更多的有机酸和氨基酸,加强了其对难溶态Cd和P的活化能力。同时,其代谢活动也会受到明显影响。(2)趋化和群游实验中,葡萄糖酸诱导下菌株T29的菌落数为3.65*106 cfu·m L-1和菌落直径为2.18 cm,相比对照分别增加130.5%和54.6%。体外实验中,在菜心根际添加了葡萄糖酸后,其根表面的菌落数为2.98×106 cfu·g-1根鲜重,相比对照增加了29.1%。盆栽实验中,接菌后菜心根部的磷、钾含量为1.63和8.05g·kg-1,与不加菌相比没有显著变化,镉的含量为2.09 mg·kg-1,相比不加菌增加了122.3%,同时茎叶中的镉、磷及钾的含量为1.73 mg·kg-1、6.3 g·kg-1和21.32 g·kg-1,相比不加菌增加了78.4%、49.3%和56.4%。根与茎叶的干重分别为0.49和3.96 g,相比不加菌分别增加了24.2%和50.2%。同时接菌后菜心的株高为37.9 cm,约为不加菌的1.48倍。研究表明,不同的有机酸和氨基酸对T29的吸引能力存在较大差异。其中葡萄糖酸作为T29的一种信号分子,能够较好地吸引T29在菜心根部定殖并使其活化土壤中的难溶态磷、钾和镉。(3)通过对菌株T29进行全基因组测序,获得的Raw Data为760Mb,Total Reads为5,070,632条,过滤后的Clean Data为392Mb,Filtered Reads为4,825,213条,占总序列的95.16%。说明本次测序准确性较高。将Filtered Reads进行拼接组装,获得5486条基因序列,总长度为4,988,409bp,GC含量为60.59%。在11个数据库里对基因序列进行功能注释,其中GO、IPR、KEGG、COG、NR、SwissProt、TrEMBL、CAZy、ARDB、PHI、T3SS注释的基因数量分别为3426、4606、3299、4353、5210、2143、5164、92、21、109和477条。而与碳水化合物、氨基酸代谢有关的基因分别为346和347条。
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