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背景先天性肾病综合征(congenital nephrotic syndrome,CNS)是一类非常罕见的肾病综合征,通常定义为在出生后3个月内发生的肾病综合征,其临床表现符合大量蛋白尿、低白蛋白血症、严重水肿和高胆固醇血症的肾病综合征诊断标准。根据病因可为分原发性(遗传性)和继发性(非遗传性)先天性肾病综合征,其中原发性CNS是肾小球滤过屏障组成蛋白的编码基因或其他相关基因突变所致,继发性CNS多因孕妇宫内感染或孕妇自身疾病等所致,而遗传性因素所致的CNS占主要地位。先天性肾病综合征的预后非常差,大多数病例死于出生后的半年以内,唯一有效的治疗方式是肾移植。因此如何对先天性肾病综合征家系进行产前诊断及遗传咨询,帮助该罕见病家系确定致病因素,进而指导优生实现健康生育是一个重要的临床课题。目的1.本研究通过对一个先天性肾病综合征家系的临床资料进行收集、分析,以总结特征性的临床表型帮助正确诊断识别CNS。2.借助高通量测序手段进行CNS候选致病基因的筛选。3.对发现的可疑致病性突变位点进行初步功能性验证,从多个角度阐明先天性肾病综合征的遗传学病因。材料及方法:1.本研究收集了一个先天性肾病综合征家系的临床病例资料,回顾了该家系中2次不良妊娠时CNS患儿的相关临床检查及化验结果,认识CNS的常见临床表现。指导家系中母亲妊娠时加强产检,于孕中期行血清学筛查及羊膜腔穿刺以排查神经管缺陷、染色体结构异常及染色体拷贝数变异(copy number varations,CNVs),根据产检结果认识CNS患儿宫内的临床表现及胎儿羊水特征性的改变。2.查阅遗传性CNS的相关文献后选择北京康旭医学检验所基于高通量测序平台的目标序列靶向捕获测序技术,选用其中的遗传性肾病相关基因检测包(Panel),针对目前已报道的所有与遗传性肾病相关的270个基因的全部外显子及相邻内含子区域进行高通量测序,借助生物信息学软件分析筛选出CNS患儿可疑致病基因,并利用Sanger测序在家系中对候选基因的可疑致病性位点进行遗传共分离验证。3.通过剪切位点预测网站比较NPHS1基因c.712+5G>A突变前后NPHS1基因剪切位点的变化,初步预测NPHS1基因c.712+5G>A对基因转录剪切环节的影响。构建NPHS1基因c.712+5G>A变异野生型及突变型质粒,分别转染293T细胞,提取转染质粒后细胞的总RNA,进行RT-PCR扩增和测序,比较得出突变位点对NPHS1基因转录本的影响;提取转染质粒后的细胞蛋白,进行Western Blot实验比较NPHS1基因c.712+5G>A突变前后nephrin蛋白表达情况的变化;质粒转染Hela细胞进行免疫荧光染色,观察NPHS1基因c.712+5G>A突变前后nephrin蛋白表达有无差异;利用I-TASSER软件对野生型和突变型的蛋白氨基酸序列进行三级结构模型构建,比较二者之间的差异。结果:1.该家系为中国汉族人群,家族中无近亲婚史及遗传病史,两次妊娠时母亲均无明确感染史。家系中第一胎患儿出生后即表现为大量蛋白尿、低白蛋白血症、水肿和高胆固醇血症的典型肾病综合征表现,对症支持治疗3月后因急性肾衰竭、重症肺炎夭折。第二胎患儿中孕期以后在宫内即表现出母体外周血及羊水甲胎蛋白(AFP)明显高于相同孕周水平,而神经管缺陷的特异性指标胆碱酯酶在正常水平。同时胎儿系统超声提示二胎患儿存在双肾体积略增大、回声略增强的超声软指标异常。2.高通量测序检测到CNS患儿携带NPHS1基因c.712+5G>A和c.3325C>T的复合杂合变异,其中NPHS1基因的c.3325C>T是先天性肾病综合征芬兰型(congenital nephrotic syndrome-Finnish type,CNF)的主要热点突变,c.712+5G>A为首次报道的变异。在家系中进行Sanger测序验证,结果显示胎儿父亲携带NPHS1基因c.712+5G>A变异,母亲携带NPHS1基因c.3325C>T变异,在家系中存在遗传共分离现象,符合常染色体隐性遗传规律。3.生物信息学分析软件预测NPHS1基因c.712+5G>A变异会导致NPHS1基因6号外显子5′端剪接受体被破坏,很大可能导致pre-mRNA剪切的异常。体外实验证实NPHS1基因c.712+5G>A导致与野生型质粒相比,突变型质粒在转录水平发生了变化,具体表现为NPHS1基因cDNA序列异常,产生了缺失了5号及6号外显子序列的转录本。Western Blot实验证实与野生型质粒相比,突变型质粒的nephrin蛋白表达异常;免疫荧光染色证实,与野生型质粒相比,突变型质粒的nephrin蛋白表达明显减少;蛋白三级结构功能预测结果显示突变型nephrin蛋白结构明显改变,导致蛋白结构不稳定,从而失去生物活性和生物功能。结论:该CNS家系临床表型符合遗传性CNS的典型临床表型,孕期母体外周血及胎儿羊水AFP水平异常升高是CNS特征性的生化指标,可作为遗传性CNS的产前筛查指标。NPHS1基因是该家系的可疑致病基因,NPHS1基因的c.712+5G>A变异和c.3325C>T变异为该CNS家系的可疑致病位点,其中c.3325C>T变异为已知的CNF的致病性突变位点,而c.712+5G>A变异为新发突变致病性未知,进一步体外实验验证显示NPHS1基因c.712+5G>A变异会影响NPHS1基因的正常剪切,产生异常的转录本,导致NPHS1基因编码的nephrin蛋白表达异常,进而影响蛋白的生物活性和生物功能,这很可能就是该CNS家系的致病机理。