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目的:糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)可导致多种糖尿病慢性并发症的发生,包括糖尿病认知功能障碍。过氧化物酶体增殖激活受体γ(Peroxisomeproliferators-activated receptorγ,PPARγ)对细胞的生长、分化及凋亡具有煎要影响。本实验通过PPARγ小发卡RNA(Shott hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体的构建、基因沉默等技术观察AGEs对JPPARγ基因正常和缺失表达的内源性神经干细胞(:Neural stemcells,NSCs)动态变化轨迹的干预作用,阐明PPARγ在介导AGEs影响NSCs增殖和分化中的作用,为揭示糖尿病认知障碍的发病机制,防治其发生发展提供新的实验依据。
方法:1.分离孕14.5d Sprague Dawley(SD)大鼠的胎鼠海马组织,建立NSCs模型,观察其增殖、分化的形态学变化及其特异性标志物的表达;2.设计针对PPARγ脚的靶向序列,构建PPARγ基冈特异的shRNA慢病毒载体,将筛选到的重组质粒与包装质粒通过脂质体共转染293T细胞,包装生产慢病毒颗粒并测定病毒滴度。慢病毒颗粒感染PC12细胞和NSCs,分别用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印记法(Western blot)检测PPARγ基因mRNA合成及蛋白表达,验证PPARγ基因沉默效果;3.将NSCs分为野生型即空白对照组(CON)、PPARγ沉默组(S)、AGEs干预组(AGEs)、AGEs干预+PPARγ沉默组(AGEs+s)共四组。分别以400mg/L和200mg/L AGEs干预3d和7d,通过细胞计数和四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)法检测细胞增殖情况;以200mg/L AGEs干预3d,激光共聚焦成像结合免疫荧光双标法和Western blot检测并比较各组细胞微管相关蛋白2(Microtubule Associated Protein2,MAP2)与巢蛋白Nestin表达(MAP2/Nestin),观察细胞分化情况;4.数据采用SPSS13.0软件进行One-WayANOVA分析,组间比较采用Post Hoc LSD法。
结果:1.从孕14.5d的胎鼠海马组织中分离的细胞,形态学观察显示其具有自我增殖和多向分化的潜能,且Nestin表达阳性,可确立为NSCs;2.PPARγ基冈特异的shRNA正确插入到pLL3.7慢病毒载体中,成功包装生产慢病毒颗粒,病毒滴度为5×106TU/mL;重组载体可特异性抑制PPARγ基因mRNA合成及蛋白表达,抑制率分别为92.4％±2.2％、78.8％±6.0％,表明载体构建成功;3.AGEs干预后,CON组、S组、AGEs+S纽NSCs克降球数量无明显差异;AGEs组与CON组相比神经球数量明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05),PPARγ基因沉默可逆转这一效应(P＜0.05);4.MTT结果显示,CON组、S组、AGEs+S组平均吸光度值无明显差异;AGEs组吸光度明显低于CON组,差异统计学意义(P＜0.05),PPARγ基因沉默可逆转这一效应(P＜0.05);5.激光共聚焦免疫荧光双标检测结果显示,S组MAP2+/Nestin+细胞数量与Nestin+细胞数量的比值和CON组相比无明显差;AGEs组、AGEs+S组MAP2+/Nestin+细胞数量与Nestin+细胞数量的比值少于CON组,差异有统计学意义(P＜0.05),但AGEs组和AGEs+S组间无明显差异;6.Western blot结果显示,S组与CON组相比,MAP2/Nestin比值无明显差异;AGEs组、AGEs+S组MAP2/Nestin比值小于CON组,差异有统计学意义(P＜0.05),但AGEs组和AGEs+S组间无明显差异。
结论:在建立NSCs的基础上,通过构建PPARγ基因沉默的慢病毒载体成功转染NSCs,使其PPARγ基因部分缺失表达;AGEs可抑制NSCs的增殖及其向神经元方向分化;PPARγ荩因沉默对NSCs的埔殖、分化无明显影响;PPARγ可能介导AGEs对NSCs增殖的抑制作用,而AGEs抑制NSCs向神经元方向分化的过程似与PPARγ无关。