研究背景缺血缺氧是心肌最常见的损害因素之一,严重烧伤患者早期,心肌也存在缺血缺氧损害。缺血缺氧可调控心肌细胞自噬水平,但自噬对心肌损害的作用一直备受争议。目前认为自噬-溶酶体通路(autophagic-lysosomal pathway,ALP)障碍导致的自噬流受损是介导细胞损伤的重要因素。但自噬流受损介导细胞损伤的具体机制尚不清楚。自噬流受损可表现为自噬底物堆积,溶酶体体积增大,使溶酶体更易受到外界因素的损害。溶酶体膜损伤主要表现为溶酶体膜通透化(lysosomal membrane permeabilization,LMP),伴随溶酶体内容物包括质子及多种水解酶的漏出,导致胞浆酸化,介导凋亡、坏死等多种细胞死亡。既往研究提示,心肌缺血导致溶酶体水解酶分布异常及活性改变。但心肌缺血损伤中是否发生LMP缺乏确切证据,LMP对心肌细胞损伤的调控尚不清楚。溶酶体功能障碍是导致自噬流受损的重要机制,也是多种疾病的重要致病因素。近年来发现,在异丙肾上腺素注射构建的心肌梗死模型中也存在溶酶体功能障碍。调控溶酶体功能的分子包括溶酶体水解酶、溶酶体膜相关蛋白以及参与溶酶体成分分选、运输及翻译后修饰的蛋白等。但缺血所致的心肌溶酶体功能障碍的分子机制目前尚不清楚。溶酶体膜相关蛋白2(lysosomal-associated membrane protein 2,Lamp2)是重要的溶酶体膜蛋白。Lamp2突变小鼠多种组织中自噬体及大量未降解物质累积。既往研究认为,Lamp2通过促进溶酶体与自噬体融合维持自噬流。Lamp2敲除导致肝脏细胞溶酶体水解酶活性降低。同时,Lamp2在氧化应激、肿瘤细胞慢性酸性环境等多种病理条件下对细胞有重要保护作用。但Lamp2在心肌缺血损伤中发挥的作用及其机制尚不清楚。阳离子非依赖的6-磷酸甘露糖受体(cation-independent mannose 6-phosphate receptor,Cl-MPR)是靶向运输溶酶体成分的重要标签分子。Cl-MPR缺失可导致溶酶体水解酶异常分泌,引起溶酶体功能障碍。Cl-MPR由内体向高尔基体或细胞膜的运输称为逆转运,是维持其蛋白水平、避免其被溶酶体水解酶降解的重要机制。但缺血缺氧对细胞逆转运功能的影响目前尚未见报道。Cl-MPR的逆转运受逆转运体复合物的调控,心肌细胞逆转运体对Cl-MPR的调控作用尚不清楚。细胞逆转运功能还受Rab7、SNX3、细胞骨架及其动力蛋白等分子的调控。激活态的Rab7可将逆转运体募集至内体膜,促进逆转运过程。TBC1D5是相对特异的Rab7三磷酸鸟苷激活蛋白(GTPaseactivating protein,GAP),促进Rab7向失活态转变从内体膜解离。TBC1D5对细胞逆转运功能及Cl-MPR的调控目前尚有争议,对逆转运过程的调控机制有待进一步研究。本研究从缺血缺氧心肌细胞溶酶体及自噬流的变化入手,说明自噬流受损、LMP及细胞损伤的关系。进一步探讨自噬流受损的具体环节及相关机制,揭示调控缺血缺氧心肌细胞溶酶体功能障碍的重要分子。在此基础上探究Lamp2对缺血缺氧心肌细胞的作用及相关机制。最后,进一步探究缺血缺氧心肌细胞逆转运功能的改变及相关分子机制。研究方法1.体外构建心肌细胞缺血缺氧模型,吖啶橙(acridine orange,AO)释放实验、galectin 3(Gal3)免疫荧光及胞浆组织蛋白酶B(cathepsin B,Cat B)活性检测LMP的改变。采用组织蛋白酶抑制剂或Cat D siRNA处理缺血缺氧心肌细胞,细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)8及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验检测细胞活力及毒性的改变。蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测缺血缺氧心肌细胞自噬标志物的改变、mCherry-GFP标记的LC3腺病毒感染心肌细胞观察自噬体和自噬溶酶体的变化。通过药物及ATG5 siRNA调控自噬流,检测细胞活力及毒性的改变及LMP的变化。2.采用Cat B荧光检测试剂盒探究缺血缺氧心肌细胞Cat B活性的改变,免疫荧光共定位检测组织蛋白酶与溶酶体共定位的改变,WB检测Cl-MPR和阳离子依赖的6-磷酸甘露糖受体(cation-dependent mannose 6-phosphate receptor,CD-MPR)蛋白水平的变化,探究缺血缺氧心肌细胞溶酶体功能的改变及可能机制。3.WB及免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测缺血缺氧对心肌细胞溶酶体膜相关蛋白的影响。腺病毒感染原代心肌细胞构建Lamp2过表达细胞模型,检测Lamp2过表达对心肌细胞Cl-MPR及CD-MPR蛋白水平及溶酶体组织蛋白酶定位的调控作用。进一步检测Lamp2过表达对缺血缺氧心肌细胞自噬流、LMP及心肌细胞损伤的调控作用,揭示Lamp2在缺血缺氧损伤中的作用及其机制。4.IF检测缺血缺氧心肌细胞Cl-MPR及GLUT4分布的改变,揭示缺血缺氧对逆转运功能的影响。调控溶酶体酶活性、自噬活性及逆转运体蛋白水平后检测Cl-MPR的变化,探究溶酶体酶、自噬及逆转运体对Cl-MPR的调控作用,进一步揭示缺血缺氧对心肌细胞逆转功能的影响。检测缺血缺氧心肌细胞逆转运体复合物蛋白水平及向晚期内体/溶酶体募集的改变。IF及FRAP实验检测缺血缺氧对心肌细胞Rab7活性及膜循环的影响,WB检测TBC1D5蛋白水平的改变。分别在常氧及缺血缺氧条件下调控TBC1D5水平,检测Cl-MPR的改变。缺血缺氧心肌细胞过表达TBC1D5同时转染VPS29 siRNAs,探究TBC1D5通过逆转运体对Cl-MPR的调控作用。在常氧及缺血缺氧条件下调控TBC1D5检测逆转运体蛋白水平及Rab7膜循环的改变,进一步探究TBC1D5调控逆转运过程的机制。常氧条件下敲除TBC1D5,免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)及IF检测逆转运体与微管及动力蛋白结合的改变,检测逆转运体向晚期内体/溶酶体的募集情况。常氧及缺血缺氧情况下调控TBC1D5检测溶酶体组织蛋白酶定位的改变。结果1.缺血缺氧导致心肌细胞溶酶体膜损伤,Cat B漏出,发生LMP,抑制Cat B、Cat D活性或敲除Cat D,心肌细胞损伤减轻。缺血缺氧引起心肌细胞自噬流受损,自噬体及自噬溶酶体堆积。改善缺血缺氧心肌细胞自噬流受损,LMP及心肌细胞损伤减轻,进一步加剧自噬流受损可加重LMP及心肌细胞损伤。2.缺血缺氧心肌细胞溶酶体Cat B活性显著下降,Cat B及Cat D在溶酶体内分布减少,Cl-MPR及CD-MPR蛋白水平显著下调。说明缺血缺氧导致心肌细溶酶体功能障碍,Cl-MPR及CD-MPR的减少可能是重要原因。3.缺血缺氧导致心肌细胞Lamp1增多、Lamp2减少。过表达Lamp2可显著上调CD-MPR水平、增加组织蛋白酶在溶酶体的分布,对Cl-MPR蛋白水平无明显影响。过表达Lamp2可显著减少缺血缺氧心肌细胞自噬体及自噬溶酶体的堆积,改善自噬流受损。过表达Lamp2心肌细胞Cat B漏出减少,溶酶体膜损伤减轻,心肌细胞活力增强、细胞损伤减轻。4.缺血缺氧心肌细胞GLUT4在溶酶体内分布增多,Cl-MPR在高尔基体内分布减少,在内体/溶酶体分布增多,抑制溶酶体酶活性或下调自噬水平显著增加了Cl-MPR蛋白水平,敲除VPS29导致常氧组Cl-MPR蛋白减少,缺血缺氧组稍下降,说明缺血缺氧心肌细胞逆转运功能障碍,导致Cl-MPR减少。缺血缺氧心肌细胞逆转运体蛋白水平及其与内体膜的结合无明显下调,但Rab7向激活态转变,膜循环速度及幅度显著下降,TBC1D5蛋白水平显著降低。TBC1D5过表达促进缺血缺氧心肌细胞Rab7膜循环,增加Cl-MPR蛋白水平,常氧敲除TBC1D5与缺血缺氧组结果类似,TBC1D5过表达细胞Cl-MPR的增多可被VPS29 siRNA抑制,说明缺血缺氧引起的TBC1D5下调通过损害逆转运功能,引起Cl-MPR的减少。敲除TBC1D5导致逆转运体与微管及动力蛋白结合减少,与内体膜解离障碍。过表达TBC1D5显著增加组织蛋白酶在溶酶体的分布,敲除TBC1D5可导致组织蛋白酶在溶酶体内分布减少。结论1.缺血缺氧通过介导自噬流受损引起心肌细胞LMP的发生,是导致心肌细胞损伤的重要环节。2.缺血缺氧引起心肌细胞溶酶体功能障碍,表现为组织蛋白酶运输及成熟障碍,降解活性降低。3.缺血缺氧引起心肌细胞Lamp2蛋白水平降低,过表达Lamp2可改善组织蛋白酶靶向运输障碍,减轻自噬流受损及LMP,保护缺血缺氧心肌细胞。4.缺血缺氧通过下调TBC1D5蛋白水平阻碍Rab7膜循环,导致心肌细胞逆转运功能障碍,引起Cl-MPR在溶酶体内降解增多、蛋白水平显著下调。TBC1D5缺失通过抑制逆转运体与微管及动力蛋白的结合引起逆转运体与内体解离障碍。TBC1D5是调控心肌细胞组织蛋白酶分布的重要分子。