论文部分内容阅读
抗菌多肽是一类具有广谱抗菌活性的阳离子肽。鸡体内共有14种β-防御素，它们密集地分布在染色体的3q3.5-q3.7上，长度为86Kb，含有63-104个氨基酸。鸡β-防御素富含疏水氨基酸残基和阳离子，不仅具有广谱的抗菌活性，更重要的是具有免疫调节作用。
本研究构建了3个重组质粒：(1)从3周龄粤黄鸡的舌头组织中分离提取总RNA，经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素AvBD-5基因全序列。对此全序列设计一对引物，扩增得到AvBD-5成熟肽基因，进一步构建重组真核表达载体pVAXl-AvBD5。(2)将委托合成的SEp9基因插入到载体pVAX1中，构建重组真核表达载体pVAXl-SEp9。(3)PCR扩增载体plRES-EGFP得到产物IRES序列，插入真核表达载体pVAX1后，再将SEp9基因插入IRES序列的上游，AvBD-5基因插入IRES序列的下游，最终构建得到双顺反子真核载体pVAXl-SEp9-AvBD5。将重组质粒pVAXl-AvBD5、pVAXI-SEp9、pVAXl-SEp9-AvBD5用阳离子脂质体Lipofectamine 2000包裹，转染到真核细胞COS7中。采用RT-PCR的方法检测重组质粒在细胞中的表达。用去内毒素质粒大量抽提法获得大量高纯度的无内毒素重组真核表达质粒，并用这些质粒作为DNA疫苗进行动物免疫试验。
动物免疫试验分为6组，包括PBS对照组、pVAX1空质粒组、pVAXl-AvBD5组、pVAXl-SEp9组、pVAXI-SEp9-AvBD5组、SE疫苗组，设置每组30只健康BALB/C小鼠。在首次免疫后的第14天、28天分别加强免疫。在首免后的7d、14d、21d、28d、35d、42d，对免疫小鼠眼眶取血，采用间接ELISA方法，检测小鼠血清中特异性IgG抗体的水平；采用实时荧光定量PCR方法，检测肠道组织中MCP-1基因表达量的差异；分离小鼠淋巴细胞，采用流式细胞术分析CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的百分含量变化。在首免后的第42天，用肠炎沙门氏菌对小鼠进行攻毒试验，检测攻毒小鼠新鲜粪便中含有肠炎沙门氏菌的菌落数，观察免疫保护效率。
研究结果表明：重组质粒pVAXl-SEp9、pVAXI-SEp9-AvBD5均能在试验动物体内刺激免疫应答反应，产生抗SEp9特异性抗体，pVAXl-SEp9-AvBD5组的IgG抗体OD45onm与对照组0.14相比，最高值达到0.33;同时能诱导肠道组织产生MCP-1，引起CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖，pVAX 1-SEp9-AvBD5组小鼠外周血液CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分含量与对照40.22％、21.18％、12.81％相比，最高分别为63.17％、43.11％、20.57％。用肠炎沙门氏菌攻毒后，pVAXl-SEp9组和pVAXl-SEp9-AvBD5组中小鼠新鲜粪便中肠炎沙门氏菌的菌落数，与对照组相比明显下降，pVAXl-SEp9-AvBD5组在攻毒后的第4天，粪便中仅含SE 22.90CFU/g。
以上研究结果证明了鸡β-防御素AvBD-5能有效刺激鸡的免疫防御系统，增加机体特异性免疫应答的能力，提高了小鼠对肠炎沙门氏菌感染的保护效率，为AvBD-5作为一种新型免疫佐剂，应用于DNA疫苗的研究与开发奠定了基础。