论文部分内容阅读
小菜蛾作为一种世界性的十字花科蔬菜重要害虫,是最早发现在田间对Bt产生抗性的害虫,日前的研究结果尚不能完全解释其Bt抗性机理,许多重要的抗性相关因素有待进一步探明。小菜蛾体内的Bt毒素受体仍是一个激烈争论的问题,Bt毒素的作用过程可能有多个受体参与,但许多潜在受体尚未被发现,受体的功能和机理仍没有完全明确。本研究在室内构建了小菜蛾抗BT毒素蛋白Cry1Ac近等基因品系,用RNA-Seq测序技术从RNA总体水平上筛选出小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系间与Bt抗性相关的差异基因,并通过QPCR方法检测了这些抗性相关基因在抗敏种群中的基因表达量。结果如下：(1)小菜蛾抗Bt毒素CrylAc近等基因系抗性和敏感种群的构建。采用了两种杂交方法构建CrylAc近等基因系。杂交方案一为自交和回交相间隔连续6轮；杂交方案二是先自交6代之后分开两个种群独立汰选和反汰选。利用ISSR技术对杂交和亲本种群背景进行了检测,结果显示杂交方案一的抗性品系经过多代回交,最终获得了与敏感品系相同的背景；而杂交方案二的正汰和反汰种群也获得了相同的背景,但由于分开隔离多代饲养,遗传距离远于杂交方案一。(2)小菜蛾抗性和敏感种群RNA-Seq测序。对小菜蛾2个抗性种群(美国抗性和广州抗性)和1个敏感种群(美国敏感)的小菜蛾中肠组织进行RNA-Seq测序,将表达谱数据比对到美国抗性种群中肠转录组文库(Accession No.:SRX101299)。一共得到36742801个clean reads。美国抗性和美国敏感之间(MK-VS-MM)显著差异基因(DEUs)个数为2925,广州抗性和美国敏感之间(GK-VS-MM) DEUs个数为2967,对这5892个DEUs进行GO分析,发现其主要集中在oxidoreductase activity和membrane lipid metabolic process上。KEGG分析表明,抗性种群与敏感种群的DEUs共同显著富集在9条pathway中。对ABC transporter pathway的分析表明,小菜蛾CrylAc抗性可能与该超家族ABCC2和ABCC10的下调表达和ABCG2的上调表达有关。分析结果为挖掘小菜蛾潜在的Bt受体基因提供了大量的数据资料。(3) RNA-Seq测序结果的QPCR验证。通过QPCR技术,用小菜蛾抗CrylAc近等基因系,对测序结果中挑选出的潜在抗性相关差异基因进行了表达量验证。结果表明,高表达、催化活性、代谢相关和ABC transporters DEUs在抗性品系中的表达量显著高于敏感品系表达量,证明了测序结果的可靠性,同时也表明这些基因的表达量变化与小菜蛾对Bt的抗性之间存在一定的联系,小菜蛾CrylAc抗性种群有可能通过增强催化、代谢活性以及ABCtransporters基因的作用来抵御或延缓抗性的发展。