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研究背景胰腺癌(Pancreatic Cancer)是恶性程度较高的消化道肿瘤。2013年美国新发胰腺癌病例为45,220,死亡人数高达38,460。在中国已占癌症死亡人口的第6-7位。由于缺乏可靠的癌症诊断标记物,胰腺癌早期诊断困难,发现时多已经局部扩散并全身性转移,丧失最佳手术机会[1]；目前常见的胰腺癌治疗化学药物,例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU),链脲霉素(streptozotocin),吉西他滨(gemcitabine)等[2],也因为细胞对药物的抵抗性,效果有限。据统计胰腺癌患者1年的相对生存率为26%,5年内仅6%[3]。肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC)是近年来肿瘤生物学研究的热点。人们发现肿瘤细胞似乎具有无限的生命力,但并非所有肿瘤细胞都能无限制的生长。其中一些肿瘤细胞的生长,转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似,因此被称为肿瘤干细胞[4,5]。肿瘤干细胞是肿瘤耐药和复发的重要原因[6]。这个发现为重新认识肿瘤的起源和本质以及临床肿瘤治疗提供了新的方向和视觉角度,诱导肿瘤干细胞分化也成为临床肿瘤治疗新的方向。目前已经在多种实体肿瘤中发现了肿瘤干细胞的存在,例如脑癌,乳腺癌,结肠癌,肺癌,前列腺癌及卵巢癌等[7-9]。在胰腺癌中也陆续报导胰腺癌干细胞的存在。Li等第一个在胰腺癌中证实了胰腺癌干细胞的存在,他们发现少量的CD44+CD24+EpCAM+的细胞系在裸鼠移植瘤模型中即可形成肿瘤,这些细胞表现出典型的干细胞自我更新的能力,能够分化成后代,激活增殖分化的信号通路等功能[10]。Olempska等发现ABC转运蛋白2(ATP-binding cassette sub-family G member2,ABCG2)和／或CD133阳性的胰腺癌具有肿瘤干细胞的特性[11]。Gou等发现胰腺癌细胞系(panc-1)的LY6E+TACSTD1+CD44+亚群在培养基中增殖形成球状,这也是肿瘤干细胞的重要特征之一[12]。Herman等证实只有CD133+的肿瘤分离细胞可以产生致瘤性,而且带有此标记物的细胞对标准化疗药物有高度抵抗性,那些CD133+CXCR4+的细胞极易形成肿瘤转移[13]。胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)是一种肠道分泌激素,因能刺激胰岛素分泌,降低食欲以及增加胰岛细胞的体积而成为近年来糖尿病研究的热点和重点,目前其类似物已被用于临床糖尿病的治疗[14,15]。除了对胰岛细胞具有作用外,研究表明GLP-1对机体的多种组织器官都具有一定的作用,如GLP-1可以延缓胃排空,增加饱胀感减少摄食,保护心脏功能等；同时大量研究证实GLP-1能增加胰岛细胞的体积,并具有诱导多种细胞分化(例如人体胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞等)的作用[16]。但GLP-1对胰腺癌干细胞是否也有诱导分化作用,还未见报道。对于各类肿瘤干细胞的分离,目前有多种分离的方法,最常见的肿瘤干细胞的分离方法是利用流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorting)检测细胞表面的标记物分子的表达[17]。在临床上,虽有表明随着化疗药物的使用,病人体内阳性细胞系的比例不断提升[18],但却没有利用化疗药物筛选肿瘤干细胞的相关报道。利用化疗药物进行筛选是否可以得到所谓的肿瘤干细胞是一个未知因素。而对于肿瘤干细胞鉴定的方法却有十分明确的报道,其鉴定方法一般包括利用肿瘤干细胞的生物学特性在体外培养进行初步的鉴定。吉非替尼(gefitinib),商品名为易瑞沙(Irresa)是一种小分子表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI),通过与细胞膜上的受体酪氨酸激酶靶向结合,阻止肿瘤细胞信号传导,实现抗肿瘤作用。表皮生长因子受体(EGFR)是一跨膜结构,由胞外区,跨膜区和胞内区组成,胞内区分为酪氨酸激酶结构域(TKD)和羧基末端结构域(CTD)两部分[19]。吉非替尼直接作用于TKD的三磷酸腺苷(ATP)结合位点,干扰ATP结合,使TK不能与EGFR的配体结合,从而阻断EGFR信号通路,抑制肿瘤细胞的分裂,增殖,血管形成和转移,并诱导其凋亡[20]。因此本课题的第一个难点在于确定吉非替尼是否可以筛选出肿瘤干细胞,其次我们需要研究GLP-1是否能减低胰腺癌干细胞的“干细胞特性(即多能性分化性、高致瘤性和对放化疗的耐药性)”。已有研究报道GLP-1可以诱导胚胎干细胞的分化,同时GLP-1可以提高化疗药物对正常肿瘤细胞的敏感性。继而,我们将观察在NOD/SCID小鼠模型中胰腺癌干细胞的致瘤性以及GLP-1对其致瘤性的影响,进一步明确GLP-1作为一种潜在抗胰腺癌干细胞药物的功效。本课题以胰腺癌细胞株为主要研究对象,从以下几个方面展开研究：1.通过化疗药物筛选胰腺癌干细胞,并对该细胞进行“干细胞特性”鉴定；2.采用细胞生物学方法,研究GLP-1对胰腺癌干细胞的“干细胞特性(即永生化生化、多能性分化性、高致瘤性和对放化疗的耐药性)’’的影响,即观察和评价GLP-1在诱导胰腺癌干细胞分化,在体外降低肿瘤增殖和致瘤性,以及增强其化疗药物的敏感性的能力；3.构建肿瘤模型,观察在裸鼠模型中胰腺癌干细胞的致瘤性以及GLP-1对其致瘤性的影响。目的采用化疗药物吉非替尼筛选富集胰腺癌干细胞,观察胰高血糖样多肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)诱导胰腺癌干细胞分化作用。方法首先用半数致死剂量的吉非替尼(50nM)连续培养胰腺癌细胞panc-1,期间每隔48小时更换一次新鲜加药的培养液,一共换液7次共2周,筛选出具有吉非替尼抵抗的肿瘤细胞。分别采用流式细胞仪检测panc-1和S-panc-1细胞中CD133+的比例、软琼脂克隆形成实验和平皿克隆形成试验检钡panc-1和S-panc-1细胞的克隆形成能力。用于鉴定吉非替尼抗性的肿瘤细胞是否具有干细胞特性。通过GLP-1诱导吉非替尼抗性的肿瘤细胞(S-panc-1)分化,检测诱导分化后对细胞内CD133+的比例,体外克隆形成能力(软琼脂克隆形成实验以及平皿克隆形成实验)的影响。建立肿瘤动物模型,观察在NOD/SCID小鼠模型中胰腺癌细胞株(panc-1),吉非替尼抗性的肿瘤细胞(S-panc-1), GLP-1诱导的吉非替尼抗性的肿瘤细胞(G-S-panc-1)在体内的肿瘤形成能力。结果胰腺癌细胞(panc-1)经半数致死剂量的吉非替尼(50nM)处理2周后,通过流式细胞仪检测发现S-panc-1细胞中CD133+细胞比例[(55.5±1.7)%]明显高于panc-1细胞[(1.7±0.2)%](P<0.01),软琼脂克隆形成实验显示吉非替尼抗性的肿瘤细胞(S-panc-1)的体外克隆形成能率(1.2±0.16)%明显高于panc-1细胞(0.31±0.02)%,P<0.05。经GLP-1(10nM)处理后72小时后,G-S-panc-1细胞中CD133+细胞比例由[(32.3±3.2)%]下降到[(6.1±1.3)%](p<0.01),并且体外克隆形成能力也有所下降。在裸鼠移植瘤模型中GLP-1处理后的吉非替尼抗性的肿瘤细胞(G-S-panc-1)其体内成瘤能力明显降低,接近正常panc-1细胞水平。结论经半数致死量吉非替尼筛选后的吉非替尼抗性细胞(S-panc-1)具有肿瘤干细胞特征,而GLP-1对胰腺癌干细胞具有诱导分化作用,可显著降低其“干性(包括表面标记物,体内外克隆形成能力)”。该研究为临床胰腺癌治疗提供一种化疗药物及分化药物联合应用的新思路。