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好氧堆肥的实质是微生物作用下的物质转化过程。因此,堆肥微生物的种群变化一直是人们研究的热点。静态好氧堆肥过程物料存在时空差异性,无论是按照时间、空间还是温度进行微生物种群分类均存在一定局限性。另一方面,目前对于高通量测序结果的分析通常采用降低维度,保留样本之间欧氏距离等手段来反映样品微生物种群间差别,这些分析方法对于离散型、样本序列大小差异较大的微生物种群分析不够精确。本研究在堆肥的不同时间和深度采集样品,采用Illumina高通量测序技术对堆肥微生物种群进行测定。利用狄利克雷多项式混合模型(DMM)进行微生物种群结构分析,以期可以更加全面、真实的反应出堆肥中微生物种群演替过程。在充分了解堆肥过程优势种群的前提下,筛选出优势、高效、耐热、抗病菌株,优化发酵条件。将其接种到堆肥中,增强菌株定殖能力,提升生物有机肥产品稳定性。主要研究结果如下:
(1)本研究表明堆肥过程的理化指标存在时间和空间的差异。堆肥深度主要影响温度、pH和GI。
(2)通过高通量测序共检测到5372个细菌OTUs(Operational Taxonomic Unit),其中包括42个古细菌OTUs;670个真菌OTUs。OTUs数量前四位的门级细菌分别是细菌未知菌门(Bacteria unclassified,1553),变形菌门(Proteobacteria,1232),厚壁菌门(Firmicutes915)以及放线菌门(Actinobacteria,456)。相对丰度最高的四个菌门为细菌未知菌门(Bacteria unclassified,23.56%),厚壁菌门(Firmicutes,19.91%),绿弯菌门(Chloroflexi,13.14%)以及变形菌门(Proteobacteria,12.74%)。子囊菌门(Ascomycota)是绝对优势的真菌。子囊菌门有317个OTUs和94.17%的相对丰度。
(3)狄利克雷多项式模型将堆肥样品按照其细菌种群结构组成不同分为三个类型(type I,type II,type III)。堆肥初期的样品主要集中在第一类型中(type I),相对丰度较高的OTUs为栖热菌门(Thermus)的栖热菌属(Thermus sp.,13.37%),厚壁菌门(Phylum Firmicutes)的嗜热菌属(Thermaerobacter sp.,12.81%)和直丝菌属(Planifilum sp.,9.07%)。堆肥中期的样品主要集中在第二类型中(type II),绿弯菌门(Chloroflexiunclassified sp.,8.04%),厚壁菌门的芽孢杆菌属(Bacillus sp.7.62%)和放线菌门的热多孢菌属(Thermopolyspora sp.,5.95%)在type II中有较高的相对丰度。堆肥后期的样品主要集中在第三类型中(type III),绿弯菌门(Chloroflexi unclassified sp.:6.18%)是优势菌属。
(4)根据真菌种群结构组成不同,模型将其分为四个类型(type FI,type FII,typeFIII和type FIV)。堆肥初期的样品主要集中在第一类型(type FI),酵母菌属(Saccharomycetales.sp)是相对丰度最高的OTU。堆肥后期的样品主要集中在第四类型(type FIV),Scedosporium minutisporum,曲霉菌(Aspergillus cibarius)以及疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是相对丰度前三名的OTUs。堆肥中期的样品分布在第二类型和第三类型(type FII和type FIII),优势真菌 OTUs分别为粪壳菌属(Sordariales.sp)和嗜碱枝顶孢菌(Acremonium alcalophilum)与酵母菌属(Saccharomycetales.sp)和Scedosporium minutisporum。
(5)从堆肥深度分析种群变化,深度对静态好氧堆肥中的相对丰度较高的几个主要 OTUs均有显著影响。包括细菌的直丝菌属(Planifilum sp.)、嗜热菌属(Thermaerobacter sp.)、栖热菌属(Thermus.sp.)、酸杆菌Gp6(Acidobacteria Gp6 sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、绿弯菌门(Chloroflexi unclassified)和三个细菌未知菌属(Bacteria unclassified sp.)以及真菌的Scedosporium minutisporum。由此可知,在静态好氧堆肥过程中,堆肥微生物种群结构不仅存在时间上的差异,而且存在空间差异。
(6)从整个堆肥细菌种群变化来看,仅有1个OTU(芽孢杆菌属,Bacillus sp.)可以在堆肥的整个过程维持大于1.0%相对丰度。放线菌门(Actinobacteria)的优势OTUs均集中在type II中。甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.1.90%)是堆肥过程中唯一一个相对丰度超过1%的古细菌OTU,存在于type I中。
(7)本研究从堆肥的优势种群-芽孢杆菌属筛选出一株遗传稳定性好、抗菌谱广、耐高温能力强的抗病菌G68,经鉴定初步确定为枯草芽孢杆菌。采用单因素和响应面分析方法对发酵培养基和培养条件进行优化。最佳发酵培养基为(1L):麦芽糖2.18%,豆粕粉1.45%,硫酸锰0.03%,氯化钙0.02%,硫酸镁0.03%,硫酸亚铁0.02%。最佳发酵条件为:初始pH7.5,接种量5.0%,转速180 rpm/min,40℃培养36h。利用G68制备生物有机肥,经高温发酵后芽孢含量未出现大幅下降。G68具备较好的耐高温性能，可用于高温好氧堆肥。接种G68的有机肥防病效果显著提高。
(1)本研究表明堆肥过程的理化指标存在时间和空间的差异。堆肥深度主要影响温度、pH和GI。
(2)通过高通量测序共检测到5372个细菌OTUs(Operational Taxonomic Unit),其中包括42个古细菌OTUs;670个真菌OTUs。OTUs数量前四位的门级细菌分别是细菌未知菌门(Bacteria unclassified,1553),变形菌门(Proteobacteria,1232),厚壁菌门(Firmicutes915)以及放线菌门(Actinobacteria,456)。相对丰度最高的四个菌门为细菌未知菌门(Bacteria unclassified,23.56%),厚壁菌门(Firmicutes,19.91%),绿弯菌门(Chloroflexi,13.14%)以及变形菌门(Proteobacteria,12.74%)。子囊菌门(Ascomycota)是绝对优势的真菌。子囊菌门有317个OTUs和94.17%的相对丰度。
(3)狄利克雷多项式模型将堆肥样品按照其细菌种群结构组成不同分为三个类型(type I,type II,type III)。堆肥初期的样品主要集中在第一类型中(type I),相对丰度较高的OTUs为栖热菌门(Thermus)的栖热菌属(Thermus sp.,13.37%),厚壁菌门(Phylum Firmicutes)的嗜热菌属(Thermaerobacter sp.,12.81%)和直丝菌属(Planifilum sp.,9.07%)。堆肥中期的样品主要集中在第二类型中(type II),绿弯菌门(Chloroflexiunclassified sp.,8.04%),厚壁菌门的芽孢杆菌属(Bacillus sp.7.62%)和放线菌门的热多孢菌属(Thermopolyspora sp.,5.95%)在type II中有较高的相对丰度。堆肥后期的样品主要集中在第三类型中(type III),绿弯菌门(Chloroflexi unclassified sp.:6.18%)是优势菌属。
(4)根据真菌种群结构组成不同,模型将其分为四个类型(type FI,type FII,typeFIII和type FIV)。堆肥初期的样品主要集中在第一类型(type FI),酵母菌属(Saccharomycetales.sp)是相对丰度最高的OTU。堆肥后期的样品主要集中在第四类型(type FIV),Scedosporium minutisporum,曲霉菌(Aspergillus cibarius)以及疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是相对丰度前三名的OTUs。堆肥中期的样品分布在第二类型和第三类型(type FII和type FIII),优势真菌 OTUs分别为粪壳菌属(Sordariales.sp)和嗜碱枝顶孢菌(Acremonium alcalophilum)与酵母菌属(Saccharomycetales.sp)和Scedosporium minutisporum。
(5)从堆肥深度分析种群变化,深度对静态好氧堆肥中的相对丰度较高的几个主要 OTUs均有显著影响。包括细菌的直丝菌属(Planifilum sp.)、嗜热菌属(Thermaerobacter sp.)、栖热菌属(Thermus.sp.)、酸杆菌Gp6(Acidobacteria Gp6 sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、绿弯菌门(Chloroflexi unclassified)和三个细菌未知菌属(Bacteria unclassified sp.)以及真菌的Scedosporium minutisporum。由此可知,在静态好氧堆肥过程中,堆肥微生物种群结构不仅存在时间上的差异,而且存在空间差异。
(6)从整个堆肥细菌种群变化来看,仅有1个OTU(芽孢杆菌属,Bacillus sp.)可以在堆肥的整个过程维持大于1.0%相对丰度。放线菌门(Actinobacteria)的优势OTUs均集中在type II中。甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.1.90%)是堆肥过程中唯一一个相对丰度超过1%的古细菌OTU,存在于type I中。
(7)本研究从堆肥的优势种群-芽孢杆菌属筛选出一株遗传稳定性好、抗菌谱广、耐高温能力强的抗病菌G68,经鉴定初步确定为枯草芽孢杆菌。采用单因素和响应面分析方法对发酵培养基和培养条件进行优化。最佳发酵培养基为(1L):麦芽糖2.18%,豆粕粉1.45%,硫酸锰0.03%,氯化钙0.02%,硫酸镁0.03%,硫酸亚铁0.02%。最佳发酵条件为:初始pH7.5,接种量5.0%,转速180 rpm/min,40℃培养36h。利用G68制备生物有机肥,经高温发酵后芽孢含量未出现大幅下降。G68具备较好的耐高温性能，可用于高温好氧堆肥。接种G68的有机肥防病效果显著提高。