猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的严重危害我国及世界养猪业的高度接触性传染病,一直是我国养猪业的头号疫病。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病,由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起,于上世纪90年代在中国出现并蔓延,2006年暴发的以Nsp2基因发生部分缺失变异的美洲型PRRSV为主要病原的高致病性蓝耳病更加重了对我国养猪业的危害,使猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟一样成为我国当前危害最严重的另一大猪病。因此研究可靠的诊断方法对于有效控制乃至消灭两种疫病具有重要意义。基因芯片技术是基于核酸分子杂交原理的一种固相杂交技术,即以已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针,检测样品中与其互补的核酸序列,经杂交信号检测和分析,获得样品的基因序列及表达的信息。本研究的目的是建立检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒并能同时对高致病性蓝耳病进行鉴别诊断的寡核苷酸芯片方法以及猪瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法,将基因芯片技术用于两种疫病的诊断与流行病学研究。针对PRRSV寡核苷酸芯片方法,本研究的设计思路是利用美洲型PRRSV的通用探针及高致病性PRRSV鉴别探针,通过样品与芯片探针杂交,在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的同时区分高致病性PRRSV毒株；对于猪瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法,本研究的设计思路是通过比较猪瘟病毒3个基因群共10个基因亚群毒株的E2基因序列,设计并筛选灵敏度高、与其他亚群样品无交叉杂交的探针,将荧光标记的样品与芯片杂交来判定样品中猪瘟病毒所属的基因亚群。本课题的主要研究结果如下：1猪繁殖与呼吸综合征病毒寡核苷酸芯片检测方法的建立及应用本研究首先从GenBank数据库下载美洲型PRRSV序列和高致病性PRRSVNsp2基因缺失变异株序列,通过序列比对,针对美洲型PRRSV基因组ORF6-ORF7的保守序列设计美洲型PRRSV毒株的通用PCR引物,在Nsp2基因缺失区外侧两端设计扩增片段大小不同的缺失株和经典株PCR鉴别引物。根据PCR扩增区域的序列,以Oligo6.0软件分别设计5条美洲型毒株通用寡核苷酸探针和9条针对经典美洲株基因组中相对于高致病性PRRSV Nsp2基因缺失区序列的探针。探针长度为30nt～35nt, Tm值为85.0-90.9℃。同时设计4条针对增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的芯片杂交阳性对照探针,以一段与目的片段无相似性的植物基因序列作为芯片上探针点的定位探针,以一条随机的35nt序列作为芯片杂交的阴性对照探针。本研究共设计寡核苷酸探针20条。在芯片制备实验中优化了点样缓冲液、点样探针浓度及探针固定的最佳时间,确定以博奥生物有限公司生产的基因芯片点样液作为探针点样液,最佳点样探针浓度为50μmol/L,点样后于室温固定72小时探针的固定效果最好。分别以经典美洲型PRRSV和高致病性PRRS样品的cDNA为模板建立了同时扩增美洲型毒株保守序列及Nsp2基因片段的二重PCR荧光标记方法。经过探针的杂交筛选及杂交缓冲液优化,共筛选出4条美洲型毒株通用探针、4条区分经典美洲型毒株与高致病性PRRSV的鉴别探针,建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒芯片检测方法。芯片的灵敏度和特异性实验显示,本方法与常规的高致病性PRRSV RT-PCR鉴别方法灵敏度相近,芯片探针与猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒等常见猪病毒样品无非特异性杂交。以建立的寡核苷酸芯片方法对12份临床疑似样品进行了检测,在12份样品中,1份为经典美洲型PRRSV阳性,5份为Nsp2基因缺失变异株阳性,6份为PRRSV阴性。同时用高致病性PRRSV RT-PCR鉴别方法检测,其结果与芯片检测结果完全一致,显示了芯片方法的可靠性。由于高敏感性的PCR方法有时会发生非特异性扩增,本研究针对两个PCR扩增片段各设计多条探针,通过特异性探针与PCR扩增的靶标杂交,能够避免常规RT-PCR由于非特异性扩增而使结果无法判定的可能性,提高了检测的特异性。同时,在一张玻片上可点制多个探针阵列,更适合大量样品的鉴别诊断和流行病学调查。2猪瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法的建立及应用本研究共收集210条各基因亚群CSFV基因组全长序列、E2基因全长序列及E2基因主要抗原位点编码区190nt序列。将所有各基因亚群毒株E2基因190nt的主要抗原位点编码区序列用clustalxl.81软件进行多重比对。选取各亚群保守序列,以参考序列正义链为模板,按照寡核苷酸探针设计原则,用Oligo 6.0软件设计长度为35nt左右的各基因亚群特异性寡核苷酸探针。为保证各亚群分型探针对于各自基因亚群毒株检测的特异性,所设计的探针与各自对应基因亚群毒株序列的错配碱基不超过3个,与其他基因亚群毒株序列错配碱基在3个以上。实验共设计各基因亚群探针86条。分别以猪瘟病毒1.1、2.1、2.2、2.3基因亚群样品的cDNA为模板,以欧盟猪瘟诊断手册中推荐的CSFV E2基因套式RT-PCR引物扩增。以外套PCR产物为模板,在内套PCR过程中进行Cy3-dCTP掺入荧光标记；同时以合成的猪瘟病毒1.2、1.3、3.1、3.2、3.3及3.4基因亚群E2基因重组质粒为模板,以内套引物进行PCR扩增标记,制备芯片杂交样品。将荧光标记的样品与阳性对照基因(EGFP)混合,与由所有基因分型探针和质控探针点制的阵列杂交,比较使用不同杂交缓冲液的杂交效果,确定最佳反应条件,在此基础上剔除与目的基因亚群样品不杂交或与其他基因亚群样品产生严重交叉杂交的探针。实验从86条探针中共筛选出41条杂交信号较强、特异性好的各基因亚群特异性探针,其中1.1亚群探针5条、1.2亚群6条、1.3亚群2条、2.1亚群4条、2.2亚群4条、2.3亚群2条、3.1亚群5条、3.2亚群4条、3.3亚群5条、3.4亚群4条。以筛选出的各亚群特异性探针及阳性对照基因探针点制阵列,根据各基因亚群代表样品与芯片杂交信号的信噪比(SNR 532值)分析,确定SNR≥1.6为探针点阳性的判定标准。实验发现2.2、2.3、3.1、3.3基因亚群样品与其他亚群个别探针仍存在微弱交叉杂交,信号分析结果表明,非特异性杂交探针点信噪比均接近临界值,远低于特异性探针点的信噪比。相比数量较多的特异性探针,非特异性探针点数量少,通过杂交图谱或信噪比分析仍能准确鉴别样品所属的基因亚群。芯片灵敏度实验显示,建立的寡核苷酸芯片方法与本室发表的猪瘟荧光定量PCR方法的灵敏度相同,均可检测到10-7稀释的CSFV Shimen株血毒cDNA。特异性实验结果表明,探针阵列与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒样品无交叉杂交。由于目前国内尚无猪瘟病毒1.2、1.3亚群及基因3群毒株流行,受样品限制,实验以包括1.1、2.1、2.2、2.3亚群的16份CSF阳性样品进行了芯片检测验证。结果显示,样品与芯片杂交均呈现各亚群特异的杂交图谱,从杂交图谱可以准确鉴别各样品所属的基因亚群。高通量和可用于鉴别诊断的检测手段对于疫病的诊断和流行病学研究具有重要意义。目前,以寡核苷酸芯片方法进行猪瘟病毒基因分型检测以及高致病性PRRSV鉴别诊断的研究尚未见报道。本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒寡核苷酸芯片方法经初步应用表明,其在高致病性PRRS的鉴别诊断与猪瘟病毒基因分型中显示了一定的应用潜力。虽然基因芯片技术在病原体检测领域的研究已大量报道,但目前多数仍处于研究阶段,相信随着技术、设备的不断发展和研究的深入,基因芯片技术将会被广泛用于病原体的检测。