论文部分内容阅读
目的:群体感应(quorum sensing,QS)系统与细菌调控小 RNA(small regulatory RNA,sRNA)在铜绿假单胞菌新陈代谢、脂多糖修饰、外膜蛋白合成、生物膜形成、毒力产生以及耐药性等多个生命活动过程中起关键调节作用。然而,在铜绿假单胞菌中sRNA是否参与QS调控及其具体机制和功能尚缺乏系统性研究。课题组前期利用生物信息学分析软件IntaRNA对铜绿假单胞菌中已注释过的sRNA进行靶基因预测,发现lasI、rhlI及rhlR等QS系统关键基因受sRNA的潜在调控。基于此,本研究先从IntaRNA预测的QS相关sRNA PrrH入手,对其进行功能研究并探索其与QS系统之间的调控关系;然后通过转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)进一步广泛筛选QS相关sRNA,为继续系统性地探讨QS相关sRNA奠定基础。本研究旨在阐明sRNA在铜绿假单胞菌QS系统中的调控作用及其相关功能,从而丰富QS系统调控网络和sRNA生物学功能,并为发展基于sRNA和QS系统的抗菌策略提供实验室依据。方法:1、明确PrrH对QS下游毒力的影响及其调控具体机制。(1)prrH过表达与敲除株构建与验证:以pROp200质粒为骨架,使用无缝连接试剂盒构建prrH过表达质粒;利用同源重组的方法构建铜绿假单胞菌prrH敲除株;利用qRT-PCR验证过表达与敲除株是否构建成功。(2)PrrH对铜绿假单胞菌毒力的影响:检测PAO1野生株、prrH敲除株及回复过表达株中受QS系统调控的主要毒力因子(绿脓素、弹性蛋白酶和鼠李糖脂)的表达情况,同时也对与其致病性密切相关的生物膜以及动力进行检测;采用体外血流感染模型检测以上菌株在血液中的生存能力(细菌菌量检测)及prrH、lasI和rhlI的基因相对表达量(qRT-PCR检测)。(3)PrrH靶基因验证实验:根据生信软件预测的PrrH和靶标mRNA结合位点,构建pUCP30T-mRNA-gfp和pUCP30T-mRNA-mut-gfp绿色荧光蛋白报告载体验证PrrH与靶mRNA间是否存在相互作用,并通过qRT-PCR验证PrrH对靶mRNA稳定性的影响。2、探究PrrH的转录调控机制。利用qRT-PCR验证QS系统关键基因lasI、rhlI是否调控PrrH;利用生物信息学工具PRODORIC分析PrrH的转录因子识别位点;利用pQF50质粒构建prrH启动子-β-半乳糖苷酶报告系统,分析转录因子对prrH启动子活性的影响。3、RNA-seq技术筛选QS系统相关sRNA。(1)利用RNA-seq技术进行转录组测序,筛选QS激活过程中以及lasI或rhlI敲除后表达变化的sRNA,并通过qRT-PCR进行验证。(2)构建候选sRNA敲除及过表达菌株。(3)检测候选sRNA对QS下游毒力的影响。结果:1、(1)成功构建prrH过表达与敲除株。(2)过表达及敲除实验结果显示PrrH抑制铜绿假单胞菌绿脓素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂及生物膜形成,促进游泳和集群运动,并减弱其在血流感染模型中的生存能力。(3)IntaRNA预测PrrH靶向QS关键基因lasI和绿脓素编码基因phzC/D,绿色荧光蛋白报告系统和qRT-PCR进一步证实LasI 与 PhzC/D 受 PrrH 抑制。2、PRODORIC分析发现RhlR在prrH启动子区存在两个结合位点,β-半乳糖苷酶报告系统和qRT-PCR进一步证实RhlR抑制PrrH转录。3、(1)RNA-seq结合qRT-PCR验证筛选出5条QS系统相关sRNA:P26、P5316.1、P34、P30 及 AmiL。(2)成功构建 P26、P5316.1、P34、P30 及 AmiL5 条sRNA过表达株,P34、P30及AmiL3条sRNA敲除株。(3)AmiL抑制、P30促进、P34几乎不影响绿脓素合成。结论:1、PrrH是铜绿假单胞菌重要的QS调节sRNA(Qrr),其参与RhlI/R-PrrH-LasI/PhzC/PhzD信号通路调控,并抑制铜绿假单胞菌毒力及血流感染能力。PrrH表达下调可能是引起铜绿假单胞菌感染的重要机制。2、转录组测序能弥补生物信息学预测的不足,更加全面、系统地筛选出多条QS系统相关sRNA。初步毒力试验表明AmiL和P30参与QS下游毒力调控,是潜在的QS相关sRNA,其具体机制有待深入研究。