论文部分内容阅读
牦牛是青藏高原地区的一种特有畜种,在自然状态下,繁殖性能低。IVF生产牦牛和犏牛胚胎的效率普遍较低。本文研究了褪黑素(MT)对牦牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育的影响,研究了体外生产条件的改变对性控犏牛胚胎发育的影响,并建立了早期性控犏牛胚胎的性别鉴定体系,为体外生产牦牛胚胎和母犏牛胚胎提供一定的科学依据,为西部牦牛和犏牛牧业发展起到一定的推动作用。研究结果如下: 1.本试验研究了开放式和微滴法对牦牛卵母细胞孤雌发育的影响,结果表明: 开放式培养(4 mL)的孤雌卵裂率(73.17±4.54%)显著高于微滴培养法(0.12-0.15 oocyte/μL)(61.64±3.27%)与微滴培养法(0.2-0.25 oocyte/μL) (54.09±3.83%)(P<0.05),但开放式培养(4 mL)的第一极体排出率和孤雌囊胚率与微滴培养法(0.12-0.15 oocyte/μL)的第一极体排出率和孤雌囊胚率差异不显著(P>0.05)。 2. 本试验研究了不同浓度 MT 对牦牛卵母细胞体外成熟、孤雌发育、种内IVF和种间IVF的影响。 结果表明: (1)牦牛成熟培养液中添加10-9mol/L MT,第一极体排出率,孤雌激活后的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组(P>0.05); (2)牦牛成熟培养液中添加10-9 mol/L MT浓度,体外受精生产牦牛胚胎和种间受精生产犏牛胚胎的卵裂率,囊胚率均显著高于无添加组(P>0.05),但孵化囊胚率无显著差异(P<0.05); (3)10-7和10-9 mol/L MT处理的牦牛卵母细胞成熟液中,成熟后MⅡ期卵母细胞内GSH的含量(12.72±0.67ng/L和11.50±0.54ng/L)显著高于无添加组(9.44±0.57ng/L)(P<0.05); (4)10-9 mol/L MT处理显著提高了牦牛卵丘细胞和成熟后卵母细胞的 GPx4 的表达水平(P<0.05),同时显著提高了成熟后牦牛卵母细胞BMP15的表达水平(P<0.05),降低了BAX的表达水平(P<0.05)。 3.本试验对体外生产性控犏牛胚胎(牦牛♀×黄牛♂)的受精时间,精液浓度,卵丘细胞脱除程度,胚胎培养环境等生产条件进行探索。 结果表明: (1)受精24 h的卵裂率和囊胚率显著高于受精6 h、18 h(P<0.05); (2)性控精液的精子密度0.4~0.6×106个/mL与4~6×106个/mL时的卵裂率差异显著(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05),都显著高于性控精液0.04~0.06×106个/mL组的卵裂率和囊胚率(P<0.05); (3)卵丘细胞不脱除组的囊胚率(23.42±2.07%)显著高于半脱除组(13.77±2.52%)和完全脱除组的囊胚率(15.61±2.22%)(P<0.05); (4)性控犏牛早期胚胎在低氧培养环境下囊胚率(23.42±2.07%)显著高于高氧培养环境(11.83±1.73%)(P<0.05),而孵化囊胚率差异不显著(P>0.05); (5)输卵管上皮细胞共培养的囊胚率( 24.63±2.49%)和卵丘细胞共培养的囊胚率(23.42±2.07%)差异不显著(P>0.05),但均显著高于FBS CR1aa培养液的囊胚率( P<0.05 ); (6)种公牛 A 的囊胚率( 18.90±2.31%)和 C 的囊胚率(19.33±2.26%)均显著高于B种公牛的囊胚率(P<0.05); (7)精卵比例为1000:1的囊胚率显著高于精卵比例为670:1和1670:1的囊胚率(P<0.05)。 4.本试验研究了MT对性控犏牛胚胎体外生产效率的影响。 结果表明: (1)在卵母细胞成熟液和胚胎培养液中分别添加10-9mol/L MT所生产的性控犏牛胚胎,孵化囊胚率显著高于对照组(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05),但两个处理组的囊胚细胞数均比对照组多; (2)成熟液中添加10-9mol/L MT能够显著上调 CAT 表达(P<0.05),但 BAX 的表达与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。 5.本试验采用了普通PCR和LAMP法进行胚胎性别的鉴定。 结果表明: (1)简单PCR即可用于犏牛胚胎的性别鉴定; (2)PCR法与LAMP法测定结果一致。 结论: 两种方法均可用于早期性控犏牛性别鉴定。