论文部分内容阅读
鸡γ干扰素(Chicken interferon-gamma,ChIFN-γ)是一类具有抗病毒活性、抗细菌与抗寄生虫的作用的细胞因子。实验室前期发现转ChIFN-γ烟草的腺毛密度增加,腺毛分泌物明显增多,抗虫性提高。通过全基因组表达谱芯片结合生物信息学分析,推测一条信号通路上的3个关键基因(CyP71、LBM1和IspH)与烟草腺毛发育相关性显著。在IspH功能研究的基础上,以剩余2个基因的功能进行研究,并通过原核表达纯化目的蛋白、应用等温量热技术(ITC)研究ChIFN-γ与3个蛋白的互作,研究结果如下:(1)构建含植物过表达载体pSH737-CyP71和pSH737-LBM1的农杆菌LBA4404,通过蘸花法遗传转化拟南芥,收集种子进行抗性筛选,分别获得到抗性植株50株和65株,基因组PCR呈阳性。GUS染色及表皮细胞显微观察显示,转CyP71拟南芥GUS染色叶片群不呈现深蓝色,数量显著增加100%;转LBM1拟南芥GUS染色,表皮毛细胞均呈蓝色,数量显著增加100%,LBM1基因的表达与拟南芥表皮毛的发育呈正相关。(2)将ChIFN-γ、IspH构建到原核表达载体获得pET28a-ChIFN-γ/BL21(DE3)和pET28a-IspH/BL21(DE3);优化CyP71和LBM1序列,分别获得pET30aCyP71/BL21(DE3)和pET30a-LBM1/BL21(DE3)。0.25-0.5 mmol/L IPTG、3L LB、15℃诱导表达14 h,超声破碎、包涵体复性、NI-IDA柱纯化、透析后,SDS-PAGE、Western blot、Bradford检测,分别获得浓度为0.616 mg/mL、纯度95%的可溶性ChIFN-γ;0.390 mg/ml、纯度为90%的包涵体复性蛋白LBM1;0.248 mg/ml的包涵体复性蛋白CyP71;浓度为0.410 mg/ml的可溶性IspH蛋白。(3)采用等温量热技术(ITC),ChIFN-γ蛋白质为配体蛋白,对IspH、CyP71、LBM1蛋白质进行滴定。结果表明:ChIFN-γ与IspH通过疏水作用发生互作,亲和力0.074μmol/L;ChIFN-γ与CyP71通过分子内氢键和范德华力互作,亲和力0.141μmol/L;ChIFN-γ与LBM1无互作关系。综上所述,ChIFN-γ可能参与了MEP途径中IspH及其下游CyP71蛋白的互作,或者ChIFN-γ引起互作蛋白构象或活性的改变,导致烟草腺毛或拟南芥表皮毛数量的增加,详细的作用机理还需要深入研究。