第一部分癌相关成纤维细胞促进卵巢癌腹水多细胞聚集体的形成及转移目的研究癌相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts,CAF）在高级别浆液性卵巢癌（High grade serous ovarian cancer,HGSOC）患者腹水多细胞聚集体（Multicellular aggregates,MCA）形成和转移中的作用。方法1.术中收取15例高级别浆液性卵巢癌患者的腹水,直接镜下观察形态、细胞免疫荧光和石蜡包埋切片后免疫组化分析腹水MCA的细胞成份及细胞表型。检测指标包括:上皮性钙粘附蛋白（E-cadherin,E-cad）、神经性钙粘附蛋白（N-cadherin,N-cad）、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast activation protein,FAP）、成纤维细胞特异性蛋白1（Fibroblast specific protein 1,FSP-1）、上皮特异性抗原（Moc-31）、核转录因子8（PAX8）、增殖细胞相关核抗原Ki-67、钙结合蛋白（calretinin）、紧密连接蛋白（claudin 4）和雌激素受体（estrogen receptor,ER）;2.原代分离培养来自无转移网膜的成纤维细胞（Normal fibroblasts,NF）及已发生转移的晚期卵巢癌网膜组织中癌相关成纤维细胞CAF。免疫组化和western blot检测CAF的特异性标志物α-SMA;3.流式细胞分选获取卵巢癌腹水中的卵巢癌细胞（上皮细胞粘附分子EpCAM阳性）。肿瘤细胞（原代腹水肿瘤细胞或SKOV3细胞）单独悬浮培养或与CAF悬浮共培养,观察多细胞聚集体MCA形成;4.悬滴法获取仅由肿瘤细胞（Tumor cell,TC）构成的多细胞聚集体MCAs^TC和由肿瘤细胞及CAF构成的多细胞聚集体MCAs^TC/CAF,比较两者的体外基质胶粘附能力;小鼠腹腔注射比较两者在体内对腹膜的粘附及定植能力;3D共培养模型间皮清除实验比较两者间皮清除能力。结果1.所有15名患者腹水内均见成球生长的MCAs,不同患者之间及个体患者中的MCAs在形状和大小方面表现出较大的异质性。MCAs中的细胞主要是E-cad阳性并且具有极性的上皮表型。E-cad^high/N-cad^negative细胞的MCAs比E-cad^low/N-cad^positive细胞的MCAs更紧密。此外,通过E-cad,N-cad和vimentin的免疫荧光证实了腹水MCAs的表型异质性。腹水内的MCAs主要由肿瘤细胞构成,Moc-31、PAX8及Ki67呈阳性表达;claudin 4、calretinin及ER呈阴性表达。CAF参与了一部分MCAs的构成,可见α-SMA、FSP-1和FAP呈阳性表达的MCAs。2.原代NF及CAF最初为星状或多突的扁平细胞,胞体大,胞核呈规则的卵圆形,汇合后呈纺锤形,细胞之间鱼贯相连或平行排列,或呈漩涡样排列;免疫组化结果显示成纤维细胞为vimentin阳性,角蛋白8阴性。CAF为α-SMA阳性,NF为α-SMA阴性。Western blot显示前三代CAF中的α-SMA表达阳性。3.CAF促进肿瘤细胞聚集以形成MCA。原代肿瘤细胞和SKOV3细胞单独或与CAF悬浮共培养5天,共培养组MCAs的数量和体积均显著大于单独培养组。4.荧光显微镜下可见悬滴法成功获取MCAs^TC和MCAs^TC/CAF。与MCAs^TC相比,MCAs^TC/CAF表现出更强的基质胶粘附能力;小鼠腹腔注射后可见MCAs^TC/CAF在肠系膜、壁层腹膜以及大网膜的粘附和种植更多;3D共培养模型间皮清除实验中,MCAs^TC/CAF间皮清除能力更强。结论HGSOC患者的腹水中的CAF促进肿瘤细胞聚集并增强MCAs中肿瘤细胞的间皮清除能力和腹腔粘附能力。这表明肿瘤细胞和CAF之间的细胞-细胞间作用是一种重要的卵巢癌转移机制,为基于肿瘤细胞和CAF间相互作用的靶向治疗提供了理论依据。第二部分癌相关成纤维细胞外泌体促进卵巢癌转移目的外泌体（Exosome,Exo）是一种由细胞分泌的,直径在30-150nm的纳米级囊泡结构,其包含多种内容物,如蛋白质（膜受体,受体的配体及细胞因子等）,核酸类物质（如m RNA,mi RNA,lnc RNA,DNA）以及脂质,是细胞间相互交流对话的重要机制之一,能调控受体靶细胞功能。近年来的研究表明,CAF能够通过外泌体与肿瘤细胞对话。而与正常成纤维细胞（Normal fibroblasts,NF）相比,CAF的mi RNA表达谱差异明显。本部分研究目的是探讨CAF来源的外泌体（Cancer-associated fibroblasts derived exosomes,CAF-Exo）对卵巢癌细胞转移能力的影响和机制。方法1.原代培养未发生转移的早期卵巢癌网膜组织（8例）中的NF及已发生转移的晚期卵巢癌网膜组织（10例）中CAF。超速离心法提取CAF-Exo和NF来源的外泌体（Normal fibroblasts derived exosomes,NF-Exo）并鉴定:电镜观察外泌体形态特征;Western blot检测外泌体的标记蛋白;Nano Sight纳米颗粒跟踪分析和DLS（Dynamic Light Scattering）动态光散射检测外泌体的粒径;2.免疫荧光法检测卵巢癌细胞对CAF-Exo和NF-Exo的摄取;3.用CAF-Exo、NF-Exo和CAF去外泌体条件培养基（Exosome-depleted conditioned medium,Exo DP-CM）处理卵巢癌细胞（SKOV3、CAOV3和A2780）72小时,未处理细胞作为对照。癌细胞的迁移及侵袭能力通过划痕实验、Transwell小室迁移及侵袭实验检测;癌细胞的增殖能力利用平板克隆形成实验及Ed U实验检测;流式检测细胞凋亡;Western blot、免疫荧光检测上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）标记物（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）的表达;4.ES2细胞经慢病毒转染荧光素酶后嘌呤霉素筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞株ES2-luc,建立裸鼠卵巢癌原位移植瘤模型,腹腔注射CAF-Exo或NF-Exo,PBS为对照,小动物活体成像观察不同处理组裸鼠腹腔转移情况及生存时间;取原发卵巢肿瘤组织行免疫组化检测E-cad、N-cad、Vimentin、Ki67的表达;5.建立ES2-luc裸鼠卵巢癌腹腔注射模型,同时给予腹腔注射CAF-Exo、NF-Exo或PBS,小动物活体成像检测外泌体对卵巢癌腹腔种植的影响,比较不同处理组小鼠的腹水及腹腔转移情况;6.从GEO网站下载2例卵巢NF和3例卵巢癌CAF来源的外泌体mi RNA测序数据集,生物信息学分析其外泌体中的差异性mi RNA。实时荧光定量PCR验证CAF和NF细胞及其外泌体中差异mi RNA的表达。TCGA数据库下载卵巢癌组织样本数据集,分析mi RNA表达水平与患者生存的关系。在mi RNA靶基因预测网站（mi RTar Base、mi RDB、mi RWalk）进行下游靶基因预测,筛选出候选mi RNA进行功能学验证;7.CAFs转染Cy3（红色荧光）标记的mi R-29c mimics和mi R-203 mimics后,与带绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）的SKOV3细胞间接共培养。RT-PCR检测转染后CAF及外泌体中两种mi RNA的表达。共培养48h后荧光显微镜观察SKOV3-GFP细胞中的红色荧光以确定mi R-29c和mi R-203是否可以通过CAF-Exo从CAF转移到卵巢癌细胞。RT-PCR检测共培养后SKOV3-GFP细胞两种mi RNA的表达;8.转染mi RNA mimics入卵巢癌细胞（SKOV3和CAOV3）过表达mi RNA-29c和mi R-203,RT-PCR验证过表达。Western blot检测基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）表达;癌细胞的迁移和侵袭能力采用Transwell迁移侵袭实验及划痕实验检测。上皮间质转化EMT的标记物Vimentin、E-cadherin和N-cadherin通过Western blot和免疫荧光法检测。结果1.提取的原代CAF-Exo和NF-Exo在透射电镜下呈类圆形双层立体膜性囊泡。通过电镜、Nano Sight和DLS测定外泌体大小,外泌体直径分布在30-150nm之间,CAF-Exo和NF-Exo峰值分别在109nm和116nm。外泌体高表达阳性标记蛋白CD63,CD9和CD81,不表达阴性标记物calnexin。2.卵巢癌细胞SKOV3,CAOV3和A2780均能摄取CAF-Exo和NF-Exo。3.与NF-Exo和Exo DP-CM相比,CAF-Exo能明显提高癌细胞的迁移及侵袭能力。CAF-Exo处理癌细胞后,E-cad表达减少,N-cad和Vimentin的表达有所增高,能促进EMT。且CAF-Exo能使癌细胞增殖能力增强,并抑制其凋亡。4.裸鼠卵巢癌原位移植瘤模型中,与NF-Exo、Exo DP-CM和PBS组相比,CAF-Exo腹腔注射组卵巢癌转移更快,小鼠生存期缩短,免疫组化显示卵巢原位瘤中Vimentin、N-cad、MMP2和Ki67的表达量增加,而E-cad表达降低。5.裸鼠卵巢癌腹腔注射模型中,CAF-Exo腹腔注射能促进卵巢癌的腹膜腔播散和腹水生成。6.GEO数据分析筛选出CAF-Exo较NF-Exo存在显著性差异表达下调的mi RNA 6个,上调的mi RNA 5个。RT-PCR结果显示,与NF-Exo相比,CAF-Exo中这6个mi RNA均有不同程度下调,其中mi R-29c和mi R-203表达水平与患者总生存时间呈正相关。下游靶基因预测发现,mi R-29c和mi R-203有16个最可能的共同靶基因:ABCE1、BTG2、CAND1、MMP2、VEGFA等。结合本实验室前期测序结果:ES2-luc的网膜高转移亚细胞系ES2-luc-omp3中10种MMP高表达,其中MMP2增加倍数最大,我们筛选出mi R-29c和mi R-203进行后续研究。7.体外间接共培养模型证实Cy3标记的mi R-29c和mi R-203 mimics能通过外泌体从CAF传递到卵巢癌细胞,在卵巢癌细胞中可见红色荧光,且卵巢癌细胞中mi R-29c和mi R-203的表达上调。8.卵巢癌细胞转染mi R-29c mimics后,Western blot结果显示MMP2表达减少,而转染mi R-203 mimics后,MMP2表达没有明显变化。此外,过表达mi R-29c能抑制卵巢癌细胞迁移侵袭以及EMT。结论CAF通过向肿瘤细胞递送低表达mi R-29c的外泌体,可能通过解除肿瘤细胞中MMP2的表达抑制,从而促进卵巢癌转移。mi R-29c抑制MMP2表达的机制以及MMP2在卵巢癌转移中的作用还有待进一步研究和验证。