【摘 要】
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疟疾是由疟原虫感染引起的虫媒传染病,每年导致全球约40万人死亡。疟原虫属于顶复门原生动物,在按蚊和脊椎动物两个宿主交替寄生。当按蚊叮咬疟疾患者时,具有传播能力的雌雄配子体随着吸血进入按蚊中肠内,迅速激活为具有受精能力的雌雄配子,进一步受精形成合子。合子变形发育为具有运动能力的新月形动合子,动合子穿越按蚊中肠建立感染。合子-动合子的变形发育是疟原虫完成按蚊传播的必需步骤。疟原虫细胞质膜膜下排布的细胞
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疟疾是由疟原虫感染引起的虫媒传染病,每年导致全球约40万人死亡。疟原虫属于顶复门原生动物,在按蚊和脊椎动物两个宿主交替寄生。当按蚊叮咬疟疾患者时,具有传播能力的雌雄配子体随着吸血进入按蚊中肠内,迅速激活为具有受精能力的雌雄配子,进一步受精形成合子。合子变形发育为具有运动能力的新月形动合子,动合子穿越按蚊中肠建立感染。合子-动合子的变形发育是疟原虫完成按蚊传播的必需步骤。疟原虫细胞质膜膜下排布的细胞骨架对于合子的变形发育必不可少,疟原虫细胞骨架主要包括内膜复合物IMC（inner membrane complex）和皮下微管 SPM（subpellicular microtubules）。然而,疟原虫如何调控 IMC和SPM的重构,如何建立和维持细胞骨架排列和稳定依然未知。本研究发现疟原虫ISP1和ISP3蛋白在合子发育早期极性共定位,在合子-动合子变形过程中维持IMC定位。利用CRISPR/Cas9技术敲除ISP1/ISP3,显著阻滞合子-动合子转化,进而阻断疟原虫按蚊传播。氨基酸突变实验发现ISP1/ISP3的IMC定位依赖于其氨基端半胱氨酸的棕榈酰化修饰,回补实验证明ISP1/ISP3的棕榈酰化修饰对其蛋白发挥功能也是必须的。为了寻找调控ISP1/ISP3上游的棕榈酰转移酶（PAT）,我们利用CRISPR/Cas9技术对疟原虫编码的11个PAT开展表达筛选,发现只有DHHC2与ISP1/ISP3在合子细胞IMC共定位。敲低DHHC2导致ISP1和ISP3棕榈酰化水平下调,IMC定位丢失;同时,合子-动合子发育完全阻断,与ISP1/ISP3双基因敲除表型一致。此外,我们还发现DHHC2蛋白羧基端多个半胱氨酸残基高度保守,并且被DHHC2自身棕榈酰转移酶活性催化。DHHC2自身棕榈酰化修饰调控蛋白定位至受精后合子细胞中新合成的IMC上。细胞超微结构分析显示,ISP1/ISP3缺失或DHHC2敲低后,SPM丢失IMC的附着,导致穹顶状微管骨架结构紊乱。机制上,ISP1/ISP3一端锚定IMC,一端与微管蛋白β-Tubulin互作,充当连接IMC与SPM的桥梁分子,以维持合子-动合子变形过程中细胞骨架的结构和稳定。本研究综合运用遗传学、分子生物学、细胞生物学和生物化学等方法揭示了合子-动合子转化过程中IMC定位DHHC2-ISP1-ISP3棕榈酰化复合物通过调控表皮细胞骨架控制疟原虫合子-动合子变形的分子机制。DHHC2通过自我棕榈酰化修饰靶向IMC,并棕榈酰化底物蛋白ISP1和ISP3使其稳定地锚定在IMC膜上,形成稳定的细胞骨架结构支撑合子细胞变形为动合子。
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