背景:肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC）是儿童腹泻病的首要原因之一,可造成出血性结肠炎和溶血性尿毒症,严重影响公众健康和生命安全。EHEC属于“A/E致病菌”家族,它的毒力依赖于它的三型分泌系统（Type Ⅲ Secretion System,T3SS）。该系统以针尖样结构在宿主细胞的细胞膜上形成通道并分泌效应蛋白到宿主细胞的细胞质中,进而劫持肠上皮细胞的生理过程,或调控免疫应答。T3SS在“A/E致病菌”发病机制中起着至关重要的作用,对三型分泌系统效应蛋白的研究对于理解A/E致病菌与宿主相互作用极其关键。目的:EspO是一种EHEC三型分泌系统向宿主细胞内分泌的的效应蛋白,其同源蛋白分布广泛。但目前现有的研究对其生理功能的认知有限。因此,该项目将重点研究EspO的生理底物和生化功能以及在EHEC感染中的作用。方法:采用自杀质粒pCVD442,以两步法的方式构建espO基因敲除菌株,通过重组的pTrc99a-EspO构建espO基因回补突变株,不同EHEC菌株感染HeLa细胞以了解效应蛋白EspO在感染过程中的生物学功能与致死作用。在真核共转染水平上探究EspO对NF-κB炎症通路的影响以及EspO的亚细胞定位。此外,采用免疫共沉淀和生物质谱等技术筛选与鉴定EspO的生理底物。结果:在寻找生理底物过程中,结合GST pull down、免疫共沉淀以及生物质谱等技术,我们鉴定到一系列相互作用的蛋白,包括微管蛋白和HSP90。免疫荧光定位发现EspO在HeLa细胞内异位表达时会聚集成液泡状或是均匀分散在细胞质内。EspO在293T细胞异位表达时,可以激活TNF诱导的NF-κB信号通路,该激活作用可以被效应蛋白Nle B所抑制。我们从EspO先前的研究报道和HSP90的功能推测EspO可能参与抗细胞凋亡作用,但需后续实验深入验证。因此构建了espO缺失菌株,感染HeLa细胞,EspO未能抑制TNF和TRAIL两种途径诱导的细胞死亡,表明EspO不参与死亡受体介导的凋亡,或者说EspO并不在这两种途径诱导的细胞凋亡过程中起作用。结论:本实验初步研究了EspO的生物学功能和底物蛋白,探究了EspO对EHEC生物学特性的影响,证实了EspO可以激活TNF诱导的NF-κB通路,探讨了EspO在TNF和TRAIL诱导的细胞死亡途径上的作用,探究EspO在EHEC感染过程中的作用,为后续深入研究EspO的功能奠定了基础。